Verschiedene Applikationsformen nicht-viraler Genvektoren im Tiermodell unter besonderer Berücksichtigung des lokalen Gentransfers
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| Sprache: | German |
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München
Hieronymus
2002
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| Schriftenreihe: | Veterinärmedizin
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Schrifttum 3
2.1 Historische Entwicklung der Gentherapie 3
2.2 Grundlagen der Gentherapie, Begriffsklärung 5
2.3 Physiologische Barrieren des Gentransfers 8
2.4 Genvektoren 10
2.4.1 Virale Genvektoren 13
2.4.1.1 Retroviren 15
2.4.1.2 Adenoviren 16
2.4.1.3 Adeno Assoziierte Viren (AAV) 17
2.4.1.4 Andere virale Vektoren 18
2.4.1.5 Vergleich viraler Vektoren 19
2.4.2 Nicht virale Genvektoren 20
2.4.2.1 Chemische Methoden 21
2.4.2.2 Physikalische Methoden 21
2.4.2.3 Synthetische Viren 23
2.4.2.3.1 Lipofektion 23
2.4.2.3.2 Polyplexe und molekulare Konjugate 26
2.4.3 Vergleich nicht viraler und viraler Genvektoren 31
2.4.4 Anwendung von Genvektoren in vivo 33
2.4.4.1 Immunologische Barrieren 33
2.4.4.2 Gewebespezifische Barrieren 35
2.4.5 Unterschiedliches Verhalten von Genvektoren in vitro und in vivo 37
2.4.6 Überwindung von Barrieren des Gentransfers in vivo 40
2.4.7 „Drug Targeting von Genvektoren 45
2.4.7.1 Einsatz von Kollagenschwämmen als Träger von Genvektoren 46
2.4.7.2 Magnetisches „Drug Targeting 52
2.4.8 Sicherheitsaspekte von Genvektoren 55
2.4.9 Evaluierung der Gentransfereffizienz durch Reportergene 56
2.4.9.1 Chloramphenicol Acetyltransferase(CAT) 57
2.4.9.2 ß Galaktosidase (ß Gal) 57
2.4.9.3 Green Fluorescent Protein (GFP) 58
2.4.9.4 Luciferase (Luc) 58
jl Inhaltsverzeichnis
3 Eigene Untersuchungen 60
3.1 Zielsetzung 60
3.2 Intravenöse Injektion nicht viraler Genvektoren im Mausmodell 62
3.2.1 Material und Methoden 62
3.2.1.1 DNA Präparation 62
3.2.1.2 Berechnung und Herstellung der nicht viralen Komplexe 66
3.2.1.2.1 Injektionslösung mit nackter pDNA 67
3.2.1.2.2 Injektionslösung mit DNA PEI Komplexen 67
3.2.1.2.3 Injektionslösung mit DNA PEI Hüllpolymer (PROCOPs) 68
3.2.1.2.4 Injektionslösung mit DOTAP Cholesterin 69
3.2.1.3 Versuchstiere und Haltungsbedingungen 70
3.2.1.4 Versuchsplan 71
3.2.1.5 Versuchsdurchführung 72
3.2.1.5.1 Organentnahme und Aufbereitung der Proben 72
3.2.1.5.2 Luciferasetest 75
3.2.1.5.3 Proteinbestimmung in Zelllysaten 76
3.2.1.5.4 Biodistribution 76
3.2.1.5.5 Enhanced Green Fluorescent Protein (= EGFP) als Reportergen 77
3.2.1.5.5.1 Histologie 78
3.2.1.5.5.2 Western Blot 78
3.3 Einsatz von kollagenschwämmen als Träger der
nicht viralen Genvektoren 82
3.3.1 Material und Methoden 83
3.3.1.1 Schwammbeschichtung 83
3.3.1.1.1 Beladung der Schwämme mit nackter pDNA 84
3.3.1.1.2 Beladung der Schwämme mit DNA PEI Komplexen 84
3.3.1.1.3 Beladung der Schwämme mit COPROGs (copolymer protected gene vectors)...84
3.3.1.1.4 Beladung der Schwämme mit Lipoplexen aus DNA und DOTAP Cholesterin ...85
3.3.1.2 Einsatz der Kollagenschwämme in vitro 85
3.3.1.2.1 Transfektion von NIH 3T3 Zellen mit vektorbeladenen Kollagenschwämmen
in vitro Versuchsansatz 1 85
3.3.1.2.2 Transfektion von NIH 3T3 Zellen und Einsetzen von unbehandelten
Kollagenschwämmen in vitro Versuchsansatz II 87
3.3.1.3 Einsatz der Kollagenschwämme in vivo: Subcutane Schwammimplantation in
Wistar Ratten und Bestimmung der Reportergenexpression 88
3.3.1.3.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen 88
3.3.1.3.2 Versuchsplan 89
3.3.1.3.3 Versuchsdurchführung 89
3.4 Lokale Anwendung der nicht viralen Genvektoren
durch magnetofektion 93
3.4.1 Material und Methoden 94
3.4.1.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen 94
3.4.1.2 Versuchsplan 94
3.4.1.3 Versuchsdurchführung 95
I
Inhaltsverzeichnis III
3.5 Datenauswertung und Dokumentation 97
3.5.1 Ergebnisse der Injektionsversuche 98
3.5.1.1 Quantitative Darstellung der Genexpression mit Luciferase als Reportergen 98
3.5.1.1.1 Absolute Kontrollgruppe mit nackter DNA 98
3.5.1.1.2 Vorversuche 100
3.5.1.1.3 Hauptversuche 104
3.5.1.2 Biodistribution 123
3.5.1.3 Darstellung der Genexpression mit EGFP als Reportergen 129
3.5.1.3.1 Qualitative Auswertung durch fluoreszenzmikroskopische Darstellung 129
3.5.1.3.2 Nachweis von EGFP in der Western Blot Analyse 130
3.5.2 Ergebnisse des Einsatzes von Kollagenschwämmen als Träger von
Genvektoren zur Verlängerung der Genexpression 131
3.5.2.1 Einsatz der Schwämme in vitro 131
3.5.2.1.1 Versuchsansatz 1 131
3.5.2.1.2 Versuchsansatz II 136
3.5.2.2 Einsatz der Schwämme in vivo 138
3.5.2.2.1 Quantitative Darstellung der Genexpression mit Luciferase als Reportergen.... 138
3.5.2.2.2 Histologische Untersuchung der Kollagenschwämme nach der Implantation.... 142
3.5.3 Lokaler Gentransfer durch die Anwendung der Magnetofektion 147
4 Diskussion 149
4.1 Durchführung von Tierversuchen 149
4.2 Diskussion der Nachweisverfahren 150
4.3 Diskussion der systemischen Applikation von Genvektoren
in der Maus 153
4.4 Diskussion über den Einsatz von Biomaterialien, die mit Genvektoren
beschichtet sind 159
4.5 Diskussion der Magnetofektion 165
4.6 Schlussfolgerung und Ausblick 167
5 Zusammenfassung 169
6 Summary 171
7 Literaturverzeichnis 172
8 Anhang 191
8.1 Verzeichnis der verwendeten Puffer und Medien 191
8.2 Berechnungstabelle für die Auswertung der Rohdaten in
Luciferase/Protein 196
9 Abbildungsverzeichnis 197
10 Tabellenverzeichnis 200
11 Abkürzungsverzeichnis 202
12 Danksagung 205
13 Lebenslauf 206
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