Die Bedeutung von Mutationen im Hämagglutinin des Masernvirus für Neurovirulenz und Antikörpererkennung
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.
1.1 EPIDEMIOLOGIE UND PATHOGENESE DER MASERNVIRUS-INFEKTION.
1.1.1 AKUTE MASERNVIRUS-INFEKTION.
1.1.2 NEUROTROPE MASERNVIRUS-INFEKTION.
12
BIOLOPE DES MASERNVIRUS (MV),.
1.2.1 TAXONOMIE.
1.2.2 MORPHOLOGIE.
1.2.3 FUNKTION DER VIRALEN PROTEINE.
1.2.4 GENOMAUFBAU UND REPLIKATION.
1.2.5 REKOMBINANTE MASEMVIREN.
13 ZELLULAERE REZEPTOREN FUER MV.
1.3.1 FUNKTION UND VORKOMMEN VON CD46.
1.3.2 STRUKTUR DES CD46 UND FUNKTION ALS MV-REZEPTOR.
1.3.3 CD46 TRANSGENE TIERE.
1.3.4 SLAM - VORKOMMEN, STRUKTUR UND FUNKTION ALS MV-REZEPTOR .
1.4 INUNUNANTWORT UND BEDEUTUNG DER ZYTOKINPRODUKTION BEI EINER
MV-INFEKTION.
1.5 NEUROVIRULENZ VON MV UND BEFUNDE IM TIERMODEO.
1.6 ZIELE DER ARBEIT.
2 MATERIAL.
2.1 GERAETE.
22
VERBRAUCHSMATERIALIEN.
23
CHEMIKALIEN.
2.4 MEDIEN, LOESUNGEN UND PUFFER.
2.4.1 ZELLKULTUR.
2.4.2 MOLEKULARBIOLOGIE.
2.4.3 PROTEINBIOCHEMIE.
2.5 KITS.
2.6 ENZYME.
2.7 OLIGONUKLEOTIDE (PRIMER).
2.8 ZELLEN.
2.9 ANTIKOERPER.
2.9.1 PRIMAERANTIKOERPER.
2.9.2 SEKUNDAERANTIKOERPER.
2.10 VIRUSSTAEMME.
2.11 VERSUCHSTIERE.
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30
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
3 METHODEN.
3.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN.
3.1.1 KULTUR ADHAERENTER ZELLEN.
3.1.2 KULTUR VON SUSPENSIONSZELLEN.
3.1.3 KULTUR VON HYBRIDOMZELLEN ZUR ANTIKOERPERGEWINNUNG.
3.1.4 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN.
3.1.5 MYCOPLASMENTESTUNG.
3.1.6 ISOLIERUNG PRIMAERER RATTENHIMZELLEN.
3.1.7 ISOLIERUNG VON RATTEN-MILZZELLEN.
3.1.8 TIERVERSUCHE.
3.1.9 RUECKKREUZUNG DER CD46 TRANSGENEN RATTEN AUF DEN GENETISCHEN
LEWIS-HINTERGRUND.
3.2 VIROLOJPSCHE METHODEN.
3.2.1 VIRUSPRAEPARATION AUF ADHAERENTEN ZELLEN.
3.2.2 VIRUSPRAEPARATION MIT SUSPENSIONSZELLEN.
3.2.3 VIRUSPRAEPARATION DES MV-STAMMS CAM/RB.
3.2.4 TITERBESTIMMUNG DER VIRUSPRAEPARATIONEN MITTELS ENDPUNKTTITRATION.
3.2.5 TITERBESTIMMUNG MITTELS PLAQUETEST.
3.2.6 PLAQUEREINIGUNG.-.
3.2.7 ULTRAZENTRIFUGATION VON VIRUS-PRAEPARATIONEN ZUR EINENGUNG.
3.2.8 VIRUSBINDUNGS-ASSAY.
3.2.9 INFEKTIONS-ASSAY.
3.2.10 HERSTELLUNG REKOMBINANTER VIREN.
33 HISTOCHEMISCHE METHODEN. .
3.3.1 IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG FUER DIE DURCHFLUSSZYTOMETNE.
3.3.2 IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG FUER DIE MIKROSKOPIE.
3.3.3 IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG FUER DIE HISTOLOGIE.
3.4 PROTEINANALYSE.-.
3.4.1 BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN.
3.4.2 HERSTELLUNG VON ZELLLYSATEN.
3.4.3 HERSTELLUNG VON GEWEBELYSATEN.
3.4.4 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE.
3.4.5 WESTEM-BLOT-ANALYSE.
3.4.6 REINIGUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN.
3 4 7 BIOTINYLIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN.
3*4.8 GLYKOSYLIERUNGSINHIBITION DER MV-H-PROTEINE WAEHREND DER VIRUSZUCHT
3.4.9 ENDOGLYCOSIDASEH-VERDAU VON VIRUS.
3.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN. .
3.5.1 BESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREKONZENTRATIONEN.
3.5.2 DNA UND RNA GELELEKTROPHORESE.
3.5.3 DNA-PRAEPARATION AUS ZELLEN ODER GEWEBEN.
3.5.4 RNA-PRAEPARATIONEN.
3.5.4.1 RNA-PRAEPARATION AUS RATTENHIMEN FUER DIE ZYTOKINANALYSE.
3.5.4.2 RNA-PRAEPARATION AUS VIRUSPRAEPARATIONEN FUER DIE SEQUENZIERUNG.
3.5.5 DNASEL-VERDAU ISOLIERTER RNA AUS GEHIRNEN.
3.5.6 REVERSE TRANSKRIPTION.
3.5.7 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION.
3.5.8 SEQUENZIERUNG.
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INHALTSVERZEICHNIS
4 ERGEBNISSE.
4.1 CHARAKTERISIERUNG DER MOLEKULAREN GRUNDLAGEN DER NEUROVIRULENZ.
4.1.1 GRUNDLAGEN.
4.1.2 ETABLIERUNG DES TESTSYSTEMS ZUR IDENTIFIZIERUNG VON
ANTIKOERPERESCAPE-MUTANTEN.
4.1.3 UEBERSICHT DER REKOMBINANTEN VIREN.
4.1.4 CHARAKTERISIERUNG DER REKOMBINANTEN VIREN BEZUEGLICH
ANTIKOERPERESCAPE.
4.1.5 TIERVERSUCHE ZUR NEUROVIRULENZ DER ERSTEN REKOMBINANTEN VIREN.
4.1.6 ERSTE IMMUNHISTOLOGIE ERGEBNISSE.
4.1.7 SEQUENZIERUNG DER NATUERLICHEN MUTANTEN CAM/K71 UND CAM/K29 AUF
ZUSAETZLICHE MUTATIONEN.
4.1.8 CHARAKTERISIERUNG DER NEUEN REKOMBINANTEN EDTAGCAMHMTL2 UND
EDTAGCAMHMTL 3.-.
4.1.9 TIERVERSUCHE DER REKOMBINANTEN VIREN EDTAGCAMHMT6 BIS
EDTAGCAMHMTL3._YY
4.1.10 TIERVERSUCH ZUR NEUROVIRULENZ DER NATUERLICHEN MUTANTEN.
4.1.11 TIERVERSUCH MIT VERSCHIEDEN CAM-STAEMMEN.
4.1.12 SEQUENZIERUNG UND ALIGNMENT VERSCHIEDENER MV-STAEMME.
4.1.13 FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNG DER MUTATION AN POSITION 200.
4.1.14 KONSTRUKTION VON EINZELMUTANTEN.
4.1.15 ANALYSE DES WACHSTUMSVERHALTENS DIESER EINZELMUTANTEN.
4.1.16 GLYKOSYLIERUNGSANALYSE DER EINZELREKOMBINANTEN DURCH DEN
WESTERN-BLOT.
4.1.17 TIERVERSUCHE MIT DIESEN EINZELMUTANTEN ZUR BESTIMMUNG IHRER
NEUROVIRULENZ.
4.1.18 ZUSAMMENSTELLUNG DER DATEN DER REKOMBINANTEN VIREN.
4.1.19 ZUSAMMENSTELLUNG DER FACS-ANALYSEN MIT ALLEN REKOMBINANTEN VIREN.
4.1.20 ZUSAMMENSTELLUNG DER TIERVERSUCHE.
4J2 VERSUCHE ZUR ETABLIERUNG EINES ZELLKULTURSYSTEMS, DAS DIE
NEUROVIRULENZ DER
UNTERSCHIEDLICHEN VIREN REFLEKTIERT.
4.2.1 VORUEBERLEGUNGEN ZUR ETABLIERUNG EINES SYSTEMS.
4.2.2 ZUSAMMENSTELLUNG DER GETESTETEN ZELLEN.
4.2.3 VIRUSBINDUNGSVERSUCHE VON UNTERSCHIEDLICHEN VIREN AN VERSCHIEDENEN
ZELLTYPEN.
4.2.4 INFEKTIONSVERSUCHE VON VERSCHIEDENEN ZELLTYPEN MIT
UNTERSCHIEDLICHEN VIREN.
43 ZYTOKINNACHWEIS IN INFIZIERTEN RATTENHIRNEN.
4.3.1 GRUNDLAGEN.
4.3.2 ERGEBNISSE DER PCR-ANALYSE ZUM ZYTOKINNACHWEIS.
4.4 CD46 TRANSGENE LEWIS-RATTEN. .
4.4.1 RUECKKREUZEN DER TRANSGENEN RATTEN AUF LEWIS-RATTEN.
4.4.2 PCR-ANALYSE ZUM NACHWEIS VON CD46.
4.4.3 WESTEM-BLOT-ANALYSE ZUM NACHWEIS VON CD46.
4.4.4 FACS-ANALYSE ZUM NACHWEIS VON CD46.
4.4.5 INFEKTIONSVERSUCHE IN VITRO MIT MILZZELLEN.
4.4.6 INFEKTIONSVERSUCHE IN VIVO.
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INHALTSVERZEICHNIS
5 DISKUSSION.
5.1 CHARAKTERISIERUNG DER MUTATIONEN IM MV-H-GEN.
5.2 MOEGLICHE STRUKTUR-FUNKTIONSBEZIEHUNGEN DER MUTATIONEN
5
3
DIE ETABLIERUNG EINES ZELLKULTURSYSTEMS.
5.4 ZYTOKINSTATUS IN UNTERSCHIEDLICH INFIZIERTEN RATTENHIRNEN.
5.5 CD46 TRANSGENE RATTEN - EIN GEEIGNETES TIERMODELL?.
93
.93
97
100
101
105
6 ZUSAMMENFASSUNG.
6.1 ZUSAMMENFASSUNG.
6.2
SUMMARY.
108
108
109
7 LITERATURVERZEICHNIS.
111
8 ABKUERZUNGEN
128
9 LEBENSLAUF.
132
10 VEROEFFENTLICHUNGEN
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