Cyclodextrin-Stoffwechsel von Klebsiella oxytoca

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1. Verfasser: Pajatsch, Markus 1969- (VerfasserIn)
Format: Abschlussarbeit Buch
Sprache:German
Veröffentlicht: 1999
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adam_text - (OIO O CYCLODEXTRIN-STOFFWECHSEL VON KLEBSIELLA OXYTOCA DISSERTATION DER FAKULTAET FUER BIOLOGIE DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN VORGELEGT VON MARKUS PAJATSCH AUS MUENCHEN IM FEBRUAR 1999 INHALTSVERZEICHNIS A. EINLEITUNG 1-13 1 . CYCLODEXTRINE, IHRE SYNTHESE UND IHR ABBAU 1 2. STAERKEABBAU UND CYCLODEXTRIN-STOFFWECHSEL IN 4 KLEBSIELLA OXYTOCA M5AL 3. PORINE 6 4. BINDEPROTEIN-ABHAENGIGE ABC-TRANSPORTER 9 B . MATERIAL UND METHODEN 14-29 1. VERWENDETE BAKTERIENSTAEMME, PLASMIDE UND OLIGONUKLEOTIDE 14 2 . ENZYME UND BESONDERE CHEMIKALIEN 18 3 . ANZUCHT VON ORGANISMEN 19 4. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 19 5. MUTAGENESE VON KLEBSIELLA OXYTOCA 21 5.1. INTEGRATION VON MUTATIONEN IN DAS CHROMOSOM VON KLEBSIELLA OXYTOCA 21 5.2. UV-MUTAGENESE 22 5.3. TRANSPOSON-MUTAGENESE 22 6. IMMUNOLOGISCHE METHODEN 23 7. BIOCHEMISCHE METHODEN 23 7.1. BESTIMMUNG DER SS-GALAKTOSIDASE- UND SS-GLUKURONIDASE-AKTIVITAET 23 7.2. A-CYCLODEXTRIN-GLYKOSYLTRANSFERASE-ABHAENGIGE UMWANDLUNG VON CYCLODEXTRINEN 23 7.3. MVJFRO-SYNTHESE VON [L^C] RADIOAKTIV MARKIERTEN SUBSTRATEN FUER DIE 24 CYCLODEXTRIN-PERMEASE 7.3.1. SYNTHESE VON [U-^C] RADIOAKTIV MARKIERTEM A-CYCLODEXTRIN MIT HOHER 24 SPEZIFISCHER AKTIVITAET 7.3.2. SYNTHESE VON [L^C] RADIOAKTIV MARKIERTER MALTOHEXAOSE 25 7.4. AUFNAHME RADIOAKTIV MARKIERTER SUBSTANZEN 26 7.5. UEBERPRODUKTION UND REINIGUNG DES CYCLODEXTRIN-PORINS CYMA AUS 27 KLEBSIELLA OXYTOCA 8 . DATENVERARBEITUNG 2 9 C. ERGEBNISSE 30-82 30 1. GENETISCHE CHARAKTERISIERUNG DES CYCLODEXTRIN-STOFFWECHSELS VON KLEBSIELLA OXYTOCA M5AL 1.1. KOMPLETTIERUNG DER NUKLEOTIDSEQUENZ DES FUER DAS WACHSTUM AUF CYCLODEXTRINEN ESSENTIELLEN GENOM-ABSCHNITTS UND DESSEN UNMITTELBARER NACHBARSCHAFT 1.1.1. SUBKLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES 5 KB GROSSEN GENOM-ABSCHNITTS MIT DEM 3~-ENDE VON CYMH UND DER DARAN ANSCHLIESSENDEN REGION 1.1.2. ANALYSE DER ERHALTENEN NUKLEOTIDSEQUENZ 1.1.3. ANALYSE DER AUS DER NUKLEOTIDSEQUENZ ABGELEITETEN GENPRODUKTE 1.2. PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR NOTWENDIGKEIT DER EINZELNEN CYM-GENE FUER DAS WACHSTUM AUF CYCLODEXTRINEN 1.2.1. PLASMIDKODIERTER CYCLODEXTRINABBAU IM HETEROLOGEN SYSTEM ESCHERICHIA COLI 1.2.1.1. KONSTRUKTION VON PCYML 1.2.1.2. KONSTRUKTION VON IN FRAME DELETIONEN IN EINZELNEN CYM-GENEN 1.2.1.3. AUSWIRKUNGEN VON DELETIONEN IN VERSCHIEDENEN CYM-GENEN FUER DAS WACHSTUM 39 AUF CYCLODEXTRINEN 1.2.2. UEBERTRAGUNG VON PLASMIDKODIERTEN MUTATIONEN IN DEN FUER DAS WACHSTUM AUF 41 CC-CD ESSENTIELLEN CYM-GENEN AUF DAS CHROMOSOM VON KLEBSIELLA OXYTOCA 1.3. EINFLUSS DES INTRAZELLULAEREN MALTODEXTRIN-STOFFWECHSELS AUF DEN ABBAU VON CYCLODEXTRINEN 30 31 32 34 36 36 36 37 43 2. CHARAKTERISIERUNG DES SUBSTRATSPEKTRUMS DER CYCLODEXTRIN-PERMEASE 44 2.1. IN VILRO-SYNTHESE VON [ 14 C] RADIOAKTIV MARKIERTEN SUBSTRATEN FUER DIE 44 CYCLODEXTRIN-PERMEASE 2.1.1. DURCH AMYLOMALTASE UND A-CYCLODEXTRIN-GLYKOSYLTRANSFERASE KATALYSIERTE 44 UMWANDLUNG VON [U- 14 C] MALTOSE IN [U- 14 C] CC-CD 2.1.2. CYCLODEXTRINASE-VERMITTELTE LINEARISIERUNG VON [ 14 C] CC-CD ZU 48 [ 14 C] MALTOHEXAOSE 2.2. UNTERSUCHUNGEN ZUR AUFNAHME VON [1 4 C] RADIOAKTIV MARKIERTEN SUBSTRATEN DURCH 49 DIE CYCLODEXTRIN-PERMEASE 2.2.1. KM-UND VMAX-BESTIMMUNG FUER DIE AUFNAHME VON [ 14 C] A-CD UND 49 [ 14 C] MALTOHEXAOSE 2.2.2. HEMMUNG DER AUFNAHME VON [ 14 C] A-CD DURCH NICHT-RADIOAKTIV MARKIERTE 50 CYCLISCHE UND LINEARE MALTODEXTRINE 2.2.3. ANALYSE DER UMWANDLUNG VON [ 14 C] A-CD IN NIEDERMOLEKULARE INTRAZELLULAERE 51 SUBSTANZEN 2.3. CYCLODEXTRIN-PERMEASE-ABHAENGIGES WACHSTUM AUF LINEAREN MALTODEXTRINEN VON 53 ESCHERICHIA COLI GM15 2.3.1- EINFLUSS DES CYCLODEXTRIN-BINDEPROTEINS CYME UND DER LAENGE DER EINGESETZTEN 53 SUBSTRATE 2.3.2. ABHAENGIGKEIT DES WACHSTUMS AUF LINEAREN MALTODEXTRINEN VON DER INDUKTION DES 55 CYM-SYSTEMS 2.4. FUNKTIONALITAET VON HYBRID-PERMEASEN AUS CYCLODEXTRIN- UND MALTODEXTRIN- 55 PERMEASEKOMPONENTEN IM WACHSTUM AUF CYCLISCHEN UND LINEAREN MALTODEXTRINEN 3. CYMA, EIN CYCLODEXTRIN-PORIN 56 3.1. FUNKTIONALITAET VON CYMA ALS MALTOPORIN 57 3.2. UEBERPRODUKTION UND REINIGUNG VON CYMA 59 4. REGULATION DES CYCLODEXTRIN-STOFFWECHSELS VON KLEBSIELLA OXYTOCA 64 4.1. AUFBAU EINES MESSSYSTEMS AUF DER GRUNDLAGE VON REPORTERGENFUSIONEN 65 4.1.1 KONSTRUKTION VON PLASMIDKODIERTEN REPORTERGENKASSETTEN, IN DENEN DIE INTERGENE 65 REGION ZWISCHEN CYMA UND CYME BIDIREKTIONAL UND TRANSLATIONAL MIT LACZ UND UIDA GEKOPPELT IST 4.1.2 INTEGRATION DER REPORTERGENKASSETTEN IN DAS CHROMOSOM VON KLEBSIELLA OXYTOCA 67 4.2. CYCLODEXTRIN-ABHAENGIGE INDUKTION DES CYM-SYSTEMS 69 4.3. EINFLUSS VERSCHIEDENER CYM- UND MAZ-GENPRODUKTE AUF DAS WACHSTUM AUF CYCLISCHEN UND LINEAREN MALTODEXTRINEN UND AUF DIE INDUKTION DES CYM-SYSTEMS 74 4.3.1. KONSTRUKTION VON KLEBSIELLA OXYTOCA STAEMMEN MIT INTEGRIERTER REPORTERGEN- 74 KASSETTE UND DELETIONEN IN CYM- UND/ODER MAZ-GENEN 4.3.2. EINFLUSS VERSCHIEDENER CYM- UND MA/-GENPRODUKTE AUF DAS WACHSTUM AUF A-CD 75 UND DIE A-CD-ABHAENGIGE INDUKTION DES CYM-SYSTEMS 4.3.3. EINFLUSS VERSCHIEDENER CYM- UND MAZ-GENPRODUKTE AUF DAS WACHSTUM AUF LINEAREN 77 MALTODEXTRINEN UND DIE MALTOHEPTAOSE-ABHAENGIGE INDUKTION DES CYM-SYSTEMS 4.4. BESTIMMUNG DES TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTS VOR CYME 79 4.5. ISOLIERUNG VON REGULATOREN DES CYM-SYSTEMS 81 D. DISKUSSION 83-93 1. AUFNAHME UND INTRAZELLULAERER METABOLISMUS VON CYCLODEXTRINEN 8 3 1.1. TRANSPORT UEBER DIE AEUSSERE MEMBRAN 85 1.2. TRANSPORT UEBER DIE CYTOPLASMAMEMBRAN 86 1.2.1. SYNTHESE RADIOAKTIV MARKIERTER SUBSTRATE FUER DIE CYCLODEXTRIN-PERMEASE 86 1.2.2. CHARAKTERISIERUNG DER CYCLODEXTRIN-PERMEASE 87 1.3. INTRAZELLULAERE UMWANDLUNG DER CYCLODEXTRINE IN NIEDERMOLEKULARE SUBSTANZEN 89 2. REGULATION DES CYCLODEXTRIN-STOFFWECHSELS 90 2.1. INDUKTION DES CYM-SYSTEMS 91 2.2. REGULATOREN DES CYM-SYSTEMS 92 E. ZUSAMMENFASSUNG 94-95 F. LITERATUR 96-103 ANHANG 1-5
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