Mikrosatelliten bei der Zuckerrübe (Beta vulgaris L.) und ihre Verwendung als molekulare Marker
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1998
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MIKROSATELLITEN BEI DER ZUCKERRUEBE (BETA VULGARIS L.)
UND IHRE VERWENDUNG ALS MOLEKULARE MARKER
VON DEM FACHBEREICH BIOLOGIE DER UNIVERSITAET HANNOVER
ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES
DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN
- DR. RER. NAT. -
GENEHMIGTE DISSERTATION
VON
DIPL-BIOL RENE GROBEN
GEBOREN AM 03.03.1968 IN BREMERHAVEN
1998
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG 1
1. DIE DEFINITION DES BEGRIFFES MIKROSATELLITEN 1
2. MIKROSATELLITEN ALS MOLEKULARE MARKER 3
3. VERWENDUNG MOLEKULARER MARKER BEI DER ZUCKERRUEBE 6
4. AUFGABENSTELLUNG DIESER ARBEIT 7
II. MATERIAL & METHODEN 9
1. ISOLIERUNG VON MIKROSATELLITEN AUS DEM GENOM VON B. VULGARIS 9
1.1. ERSTELLUNG EINER GROESSENSELEKTIERTEN GENOMISCHEN BANK 9
1.1.1. ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS B. VULGARIS 9
1.1.2. GROESSENFRAKTIONIERUNG DER DNA 10
1.1.3. LIGATION DER ZUCKERRUEBEN-DNA MIT PBLUESCRIPT 11
1.1.4. TRANSFORMATION IN E. COLI SURE 12
1.2. UNTERSUCHUNG DER GENOMISCHEN BANK AUF MIKROSATELLITEN 13
1.2.1. HERSTELLUNG VON FILTERN FUER DIE KOLONIEHYBRIDISIERUNG 13
1.2.2. AUSWAHL DER SONDEN FUER DIE HYBRIDISIERUNG 13
1.2.3. RADIOAKTIVE HYBRIDISIERUNG 15
1.2.3.1. MARKIERUNG DER SONDEN MIT [V- 32P]DATP 15
1.2.3.2. HYBRIDISIERUNG DER FILTER 15
1.2.3.3. WASCHEN DER FILTER UND AUTORADIOGRAPHIE 16
1.2.4. NICHT-RADIOAKTIVE HYBRIDISIERUNG 16
1.2.4.1. MARKIERUNG DER SONDEN MIT DIGOXIGENIN (DIG) 16
1.2.4.2. HYBRIDISIERUNG DER FILTER 17
1.2.4.3. WASCHEN DER FILTER, DETEKTION UND AUTORADIOGRAPHIE 18
IMAGE 3
1.3. ISOLIERUNG MIKROSATELLITEN-TRAGENDER PLASMIDKLONE 19
1.3.1. ISOLIERUNG POSITIVER KLONE UND MINIPREP DER PLASMIDE 19
1.3.2. UEBERPRUEFUNG DER PLASMIDE DURCH SOUTHERN BLOTS 19
1.4. SEQUENZIERUNG POSITIVER KLONE 20
1.4.1. ISOLIERUNG VON PLASMIDEN UEBER QUIAGEN-SAEULEN 20
1.4.2. MANUELLE SEQUENZIERUNG 20
1.4.3. AUTOMATISCHE SEQUENZIERUNG 21
2. SUCHE NACH MIKROSATELLITEN IN SEQUENZEN AUS COMPUTERDATENBANKEN 22
2.1. SUCHE NACH SEQUENZEN DER FAMILIE CHENOPODIACEAE 22
2.2. UNTERSUCHUNG DER SEQUENZEN AUF MIKROSATELLITEN 22
3. HOMOLOGIEVERGLEICH DER ISOLIERTEN KLONE MIT DATENBANK-SEQUENZEN 23
4. UNTERSUCHUNG AUF MIKROSATELLITEN-POLYMORPHISMEN MIT HILFE DER PCR 24
4.1. AUSWAHL GEEIGNETER PRIMER FUER DIE PCR 24
4.2. AUSWAHL UND VORBEREITUNG DES UNTERSUCHUNGSMATERIALS 24
4.2.1. PFLANZENMATERIAL 24
4.2.2. ISOLIERUNG VON DNA FUER DIE PCR (CTAB-SCHNELLMETHODE) 28
4.3. POLYMERASE-KETTENREAKTION(PCR) 29
4.3.1. OPTIMIERUNG DER REAKTIONSBEDINGUNGEN 29
4.3.2. PCR-BEDINGUNGEN 32
4.4. AUFTRENNUNG DER PCR-PRODUKTE MIT VERSCHIEDENEN GELSYSTEMEN 33
4.4.1. HOCHAUFLOESENDE AGAROSE (METAPHOR*). 33
4.4.2. DENATURIERENDE UND NICHTDENATURIERENDE POLYACRYLAMID-
GELELEKTROPHORESE (PAGE). 34
5. AUSWERTUNG DER DETEKTIERTEN POLYMORPHISMEN 35
5.1. BESTIMMUNG DER ALLELZAHL UND -GROSSE 35
5.1.1. ELEKTROPHORETISCHE GROESSENBESTIMMUNG 35
5.1.2. KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG AUSGEWAEHLTER ALLELE 35
5.2. BERECHNUNG DES PIC-WERTES DER ALLELE 36
5.3. KARTIERUNG VON MIKROSATELLITEN-MARKERN IN SPALTENDEN POPULATIONEN
36
6. BESTIMMUNG DES POLYMORPHIEGRADES WEITERER MARKERSYSTEME 37
6.1. ISOENZYMUNTERSUCHUNGEN 37
6.2. RAPD-UNTERSUCHUNGEN 37
III. ERGEBNISSE 39
1. VORKOMMEN VON MIKROSATELLITEN IN EINER GROEBENSELEKTIERTEN GENOMISCHEN
PLASMIDBANK VON BETA VULGARIS 39
1.1. ISOLIERUNG VON MIKROSATELLITEN AUS DEM GENOM DER ZUCKERRUEBE 39
1.1.1. ERSTELLUNG DER GENOMISCHEN BANK 39
1.1.2. VERGLEICH RADIOAKTIVER UND NICHT-RADIOAKTIVER TECHNIKEN 40
1.1.3. AUSWAHL DER SONDEN UND NOMENKLATUR DER KLONE 42
1.1.4. SEQUENZIERUNG POSITIVER KLONE 43
1.2. AUFTRETEN VERSCHIEDENER MIKROSATELLITEN-MOTIVE 44
1.2.1.. ERGEBNISSE DER SEQUENZIERUNGEN 44
1.2.2. FREQUENZ DER GEFUNDENEN MIKROSATELLITEN-MOTIVE 45
1.2.3. SEQUENZUNTERSUCHUNGEN DER MIKROSATELLITEN-ENTHALTENDEN KLONE 46
1.3. VORKOMMEN EINES HOCHPOTYMORPHEN MIKROSATELLITEN INNERHALB EINER
SATELLITEN-DNA . . 47
2. VORKOMMEN VON MIKROSATELLITEN IN SEQUENZEN DER CHENOPODIACEAE AUS
COMPUTERDATENBANKEN 53
2.1. SUCHE NACH SEQUENZEN DER CHENOPODIACEAE IN COMPUTERDATENBANKEN
UND DEN IN IHNEN ENTHALTENEN MIKROSATELLITEN 53
2.2. LOKALISATION DER MIKROSATELLITEN IN SEQUENZEN DER CHENOPODIACEAE 56
2.2.1. FREQUENZ DER VERSCHIEDENEN MIKROSATELLITEN-MOTIVE 56
2.2.2. MIKROSATELLITEN IN KODIERENDEN UND NICHT-KODIERENDEN BEREICHEN 58
2.2.3. MIKROSATELLITEN IN ORGANELLEN-GENOMEN 60
2.2.4. REDUNDANTE SEQUENZEN 61
3. POLYMORPHIEGRAD VON MIKROSATELLITEN INNERHALB DER GATTUNG BETA 62
3.1. OPTIMIERUNG DER VERSUCHSBEDINGUNGEN FUER DIE UNTERSUCHUNG VON
MIKROSATELLITEN-PORYMORPHISMEN 62
3.1.1. AUSWAHL DER MIKROSATELLITEN-FLANKIERENDEN PRIMER UND
OPTIMIERUNG DER PCR-BEDINGUNGEN 62
3.1.2. VERGLEICH UNTERSCHIEDLICHER TRENNSYSTEME FUER DIE ANALYSE
VON MIKROSATELLITEN-ALLELEN 66
3.2. BESTIMMUNG DER ANZAHL UND GROESSE DER MIKROSATELLITEN-ALLELE 67
IMAGE 4
3.3. PORYMORPBISMEN VON MIKROSATELLITEN IN VERSCHIEDENEN POPULATIONEN
VON BETA VULGARIS. 70
3.3.1. PORYMORPHISMEN VON MIKROSATELLITEN IN DREI VERSCHIEDENEN
KARTIERUNGSPOPULATIONEN 70
3.3.2. LINIEN UND AKTUELLES ZUCHTMATERIAL 75
3.3.3. SORTEN 78
3.3.4. SUBSPEZIES (FUTTERRUEBE, MANGOLD, ROTE BEETE) 79
3.3.5. WILDARTEN 81
3.4. BERECHNUNG DES PIC-WERTES VON MIKROSATELLITEN-MARKERN 87
3.5. VERGLEICH VON MIKROSATELLITEN-MARKERN MIT ANDEREN MARKERSYSTEMEN 91
4. UEBERTRAGBARKEIT VON MIKROSATELLITEN-MARKEM ZWISCHEN VERSCHIEDENEN
GATTUNGEN 94
4.1. VERSUCH DER OPTIMIERUNG DER PCR-BEDINGUNGEN FUER DEN EINSATZ VON
MIKROSATELLITEN IN ANDEREN SPEZIES 94
4.2. EINSATZ VON MIKROSATELLITEN AUS VERSCHIEDENEN PFLANZENARTEN BEI DER
UNTERSUCHUNG DER ZUCKERRUEBE. 95
4.2.1. SPINAT (SPINACIA OLERACEA) 95
4.2.2. GRAUMELDE (ATRIPLEX NUMMULARIA) 99
4.2.3. MOEHRE (DAUERN CAROTA). 100
4.2.4. GERSTE (HORDEUM VULGAERE} 101
4.2.5. WEIZEN (JRITICUM AESTIVUM) 102
4.2.6. ROGGEN (SEEALE CEREALE). 103
4.3. EINSATZ VON MIKROSATELLITEN-MARKERN DER ZUCKERRUEBE IN VERWANDTEN
SPEZIES ., 105
4.3.1. SPINAT (SPINACIA OLERACEA) 105
4.3.2. ROTER GAENSEFUSS (CHENOPODIUM RUBRUM). 106
IV. DISKUSSION 109
1. AUSWAHL VON MIKROSATELLITEN-MOTIVEN FUER DEN EINSATZ ALS MOLEKULARE
MARKER V 109
1.1. VORKOMMEN VON MIKROSATELLITEN IN PFLANZLICHEN GENOMEN 109
1.2. MIKROSATELLITEN IN SEQUENZEN AUS COMPUTERDATENBANKEN 115
1.3. POH/MORPHIEGRAD VERSCHIEDENER MIKROSATELLITEN-MOTIVE 117
2. METHODISCHE ASPEKTE DER MIKROSATELLITEN-ANALYSE 118
3. POH/MORPHIEGRAD VON MIKROSATELLITEN AUS B. VULGARIS UND S. OLERACEA
122
3.1. POLYMORPHIEGRAD VON MIKROSATELLITEN IN UNTERSCHIEDLICHEN
POPULATIONEN 122
3.2. VERGLEICH DES PORYMORPHIEGRADES VON MIKROSATELLITEN MIT DEM ANDERER
MARKERSYSTEME 127
4. EINSATZMOEGLICHKEITEN VON MIKROSATELLITEN-MARKERN BEI DER ZUCKERRUEBE
129
5. CBERTRAGBARKEIT VON MIKROSATEUITEN-MARKERN ZWISCHEN YERSCHIEDENEN
POPULATIONEN UND SPEZIES 133
V. ZUSAMMENFASSUNG 142
VI. LITERATUR 145
VII. ANHANG 161
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