Auswahl und Erprobung von Wirkstoffen für die isolierte hypertherme Extremitätenperfusion zur Behandlung des malignen Melanoms
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1996
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- T+AE S
AUSWAHL UND ERPROBUNG VON WIRKSTOFFEN FUER DIE
ISOLIERTE HYPERTHERME EXTREMITAETENPERFUSION
ZUR BEHANDLUNG DES MALIGNEN MELANOMS
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES
DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET IV
- CHEMIE UND PHARMAZIE - DER UNIVERSITAET REGENSBURG
VORGELEGT VON
CLAUDIA CHRISTI
AUS BLAIBACH
1996
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. DAS MALIGNE MELANOM 1
1.1.1. INZIDENZ 1
1.1.2. RISIKOFAKTOREN 2
1.1.3. PROGNOSEFAKTOREN 3
1.1.4. KLASSIFIZIERUNG 3
1.2. DIE HILP (HYPERTHERME ISOLIERTE EXTREMITAETENPERFUSION) 7
1.2.1. STELLENWERT UNTER DEN BEHANDLUNGSMETHODEN 7
1.2.2. GESCHICHTLICHER HINTERGRUND 9
1.2.3. TECHNIK 12
1.2.4. ZU GRUNDE LIEGENDE UEBERLEGUNGEN 14
1.2.5. PROBLEME UND UNGEKLAERTE SACHVERHALTE 17
1.2.5.1. BEI KLINISCHEN STUDIEN 17
1.2.5.2. BEI PRAEKLINISCHEN UNTERSUCHUNGEN 20
1.3. DAS GESAMTPROJEKT 22
1.4. THEMENSTELLUNG 24
2. MATERIALIEN UND METHODEN 25
2.1. GERAETE UND MATERIALIEN 25
2.2. CHEMIKALIEN 27
2.3. LOESUNGEN 29
2.3.1. ZELLKULTUR 29
2.3.2. HPLC 29
2.3.3. ELEKTROPHORESE 29
2.4. KULTIVIERUNG DER ZELLINIEN 32
2.4.1. MEDIEN 32
2.4.2. VERWENDETE MENSCHLICHE ZELLINIEN 33
2.4.3. KULTIVIERUNG AUF OBJEKTTRAEGERN 34
2.5. FAERBUNGEN UND NACHWEISREAKTIONEN 34 2.5.1. HISTOLOGISCHE UND
CYTOLOGISCHE FAERBUNGEN 34
2.5.1.1. KRISTALLVIOLETT 34
2.5.1.2. GIEMSA 34
2.5.1.3. PAPANICOLAOU 35
- I N-
IMAGE 3
2.5.2. IMMUNOLOGISCHE NACHWEISREAKTION FUER DAS PROTEIN S-100 35
2.6. KARYOLOGIE 35
2.6.1. CHROMOSOMENPRAEPARATION 35
2.6.2. AUSWERTUNG 36
2.7. KINETISCHER MIKROASSAY 36
2.7.1. VARIATIONEN DER DURCHFUEHRUNG 36
2.7.1.1. ZUR UNTERSUCHUNG DER CHEMOSENSITIVITAET BEI NORMOTHERMIE 36
2.7.1.2. ZUR UNTERSUCHUNG DES PH-WERT-EINFLUSSES (BEI NORMOTHERMIE) 37
2.7.1.3. ZUR UNTERSUCHUNG VON HYPERTHERMIE 37
2.7.1.3.1. WASSERBAD-METHODE 37
2.7.1.3.2. MESSUNG MIT DER REGEL-APPARATUR 38
2.7.2. AUSWERTUNG 39
2.7.2.1. KRISTALLVIOLETT-ASSAY 39
2.7.2.2. BERECHNUNG DER VERDOPPLUNGSZEITEN 40
2.7.2.3. BESTIMMUNG DER EFFEKTIVITAET DER BEHANDLUNG 40 2.8.
TEMPERATUR-ABHAENGIGE BESTIMMUNG ZELLASSO- ZIIERTEN MELPHALANS
(MUCKENSCHNABEL, 1994) ... 41
2.8.1. DURCHFUEHRUNG DER MELPHALAN-AUFHAHME IN ZELLEN 41 2.8.2.
KONDITIONIERUNG DER RP-18 EXTRAKTIONSSAEULEN 42
2.8.3. RECOVERY 42
2.8.4. VORBEREITUNG DER ZELLPROBEN FUER DIE ANALYTIK 42
2.8.5. BETRIEBSBEDINGUNGEN DER HPLC 43
2.8.6. BESTIMMUNG VON ZELLVOLUMEN UND PROTEINGEHALT 43 2.8.6.1.
BESTIMMUNG DES MITTLEREN ZELLVOLUMENS 43
2.8.6.2. BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 44
2.8.6.3. PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 44
2.8.6.4. ZUSAMMENHANG ZWISCHEN PROTEINGEHALT UND ZELLVOLUMEN 45
2.9. SDS-GELELEKTROPHORESE 45
2.9.1. PROBENBEREITUNG 45
2.9.2. PIPETTIERSCHEMA FUER EIN GROSSES GRADIENTENGEL (NACH LAEMLI, 1970)
46
2.9.3. FAERBUNG DER SDS - GELE 47
IMAGE 4
2.10. ZWEIDIMENSIONALE GELELEKTROPHORESE 47
2.10.1. PROBENBEREITUNG 47
2.10.2. ERSTE DIMENSION (ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG) 47 2.10.2.1.
VORBEREITUNG DER ROEHRCHEN 47
2.10.2.2. PIPETTIERSCHEMA FUER DIE IEF-GELE (NACH O FARRELL, 1975) 48
2.10.2.3. GIESSEN DER IEF-GELE (JANSSEN, 1993, UNIT 10.4.) 48 2.10.2.4.
IEF-BEDINGUNGEN 49
2.10.2.5. UMAEQUILIBRIEREN DER GELE 49
2.10.3. ZWEITE DIMENSION 49
3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 50
3.1. DAS SEED-STOCK-KONZEPT 50
3.2. CHARAKTERISIERUNG DER ZELLINIEN /IV W AE0 50 3.2.1. MORPHOLOGIE DER
HUMANEN MALIGNEN MELANOMZELLINIEN 51 3.2.2. ERGEBNISSE DER
ZYTOCHEMISCHEN NACHWEISREAKTIONEN 51 3.2.3. IMMUNHISTOCHEMISCHER
NACHWEIS VON S-100 53
3.2.4. KARYOLOGIE DER MELANOMZELLINIEN UND DER FIBROBLASTENKULTUR
CCD-LLLU 54
3.2.5. MINIMALE VERDOPPLUNGSZEITEN DER ZELLKULTUREN 61
3.3. CHEMOSENSITIVITAETSTESTS UNTER NORMOTHERMEN BEDINGUNGEN 62
3.3.1. LANGZEITEXPOSITION 62
3.3.2. ERMITTLUNG DER OPTIMALEN EINWIRKZEIT DER ZYTOSTATIKA 63 3.3.3.
KURZZEITEXPOSITION 66
3.3.4. DISKUSSION 67
3.4. EINFUEHRUNG DES HEPES-PUFFERSYSTEMS 69
3.5. UNTERSUCHUNGEN ZUM PH-WERT UNTER NORMOTHERMEN BEDINGUNGEN 70
3.5.1. SPEKTOPHOTOMETRISCHE MESSUNG DES PH-WERTES MIT PHENOLROT 70
3.5.2. EINFLUSS DES PH-WERTES AUF DIE ZEILPROLIFERATION 71
3.6. KURZINFORMATION ZU DEN VERWENDETEN ZYTOSTATIKA 73
3.7. PHARMAKOLOGISCHEZYTOSTATIKASTABILITAET 75
3.7.1. EINFLUSS DES PH-WERTES AUF DIE SUBSTANZWIRKUNG 75
3.7.2. EINFLUSS DER TEMPERATUR AUF DIE SUBSTANZWIRKUNG 76
IMAGE 5
3.8. UNTERSUCHUNGEN BEI HYPERTHERMIE 81
3.8.1. ZEITABHAENGIGKEIT DER HYPERTHERMIEWIRKUNG 81
3.8.1.1. ARRHENIUS-PLOT-ANALYSE 81
3.8.1.2. MORPHOLOGISCHE BEOBACHTUNGEN 89
3.8.2. KOMBINATION VON ZYTOSTATIKA MIT HT 89
3.8.2.1. PROBLEMATIK DER VERSUCHSDURCHFUEHRUNG 89
3.8.2.2. EINFLUSS DER HT AUF DIE ZYTOSTATIKAWIRKUNG - TEIL I: BEHANDLUNG
ALS SUSPENSION 91
3.8.2.3. ENTWICKLUNG EINER 12-FACH TEMPERIERUNGSVORRICHTUNG 94
3.8.2.3.1. ZIELVORSTELLUNG 94
3.8.2.3.2. AUFBAU EINES HEIZ-UND KUEHLELEMENTS 94
3.8.2.3.3. LEISTUNG DES TESTAUFBAUS 96
3.8.2.3.4. TEMPERATURMESSUNG UND -REGELUNG 97
3.8.2.3.5. KALIBRIERUNG DER MESSFUEHLER 100
3.8.2.3.6. ANSICHT DER 12-FACH TEMPERATURREGELUNG 102 - 3.8.2.3.7.
OPTIMIERUNG DER TEMPERATURREGELUNG 106
3.8.2.3.8. OPTIMIERUNG DER HOMOGENITAET DER TEMPERATURVERTEILUNG 109
3.8.2.4. EINFLUSS DER HT AUF DIE ZYTOSTATIKAWIRKUNG - TEIL II: BEHANDLUNG
ADHAERENTER KULTUREN 112
3.8.2.4.1. THERMOCHEMOSENSITIVITAET 112
3.8.2.4.2. MORPHOLOGISCHE BEOBACHTUNGEN 124
3.8.2.5. VERGLEICH DER SENSITIVITAET VON SUSPENSION UND ADHAERENTER KULTUR
125
3.9. DISKUSSION DER /AT-F/JAEO-CHEMOSENSRNVITAETSTESTS 127
3.9.1. VERGLEICH DER ERGEBNISSE AUS DEN JN-VIFRO-CHEMOSENSITIVITAETSTESTS
127
3.9.2. EINORDUNG DER THERMOCHEMOSENSITIVITAETSDATEN IN DIE LITERATUR 130
3.10. RESISTENZ 137
3.10.1. CHEMORESISTENZ 137
3.10.2. THERMORESISTENZ 141
3.11. EINFLUSS DER TEMPERATUR AUF DIE MELPHALANAUFNAHME IN SK-MEL-24
ZELLEN 142
4. ZUSAMMENFASSUNG 145
5. LITERATURVERZEICHNIS 149
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