PCR (Polymerase-Kettenreaktion) im medizinischen und biologischen Labor Handbuch für den Praktiker
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Darmstadt
GIT-Verl.
1994
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Anschriften der Autoren..........................................
Vorwort....................................................................
1. Einleitung (M. Wink) ..................................................../
ƒ.7
7.2. Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion........................
1.3. Anmerkungen zum vorliegenden Buch..............................
1.4. Gliederung des Buches...................................................12
1.5. Weiterführende Literatur.................................................13
2. Einführung in die PCR-Methodik und allgemeine
Methoden
2.1. DNA-Isolierung
2.1.1. DNA-Isolierung aus tierischem und menschlichem
Material......................................................................./5
2.1.1.1. DNA-Isolierung aus Blut..................................................15
2.1.1.1.1. Leukozyten .................................................................../5
2.1.1.1.1.1. Selektive
2.1.1.1.1.2. BuffyCoat ....................................................................16
2.1.1.1.2. DNA-Isolierung aus
2.1.2. Menschliches und tierisches Gewebe ...............................17
2.1.2.1. Frisches Gewebe, Efhanolpräparate, Gefrierpräparate ......17
2.1.2.2. Zellkulturen, Abstriche....................................................17
2.1.3. DNA-Isolierung aus Pflanzen...........................................18
2.2.
2.3. Methoden zur Charakterisierung von
PCR-Produkten (M. Hanke)..............................................24
2.3.1. Gelelektrophorese .........................................................24
2.3.2. Restriktionsanalyse.........................................................24
2.3.3. Hybridisierungsanalyse ..................................................25
2.3.4.
2.3.5. Blatten..........................................................................28
2.3.6. Hybridisierung ..............................................................29
2 3.7.
2.3.8. DNA-Markierung mit Hilfe der PCR..................................30
2.3.9. Sequenzierung..............................................................31
2.3.10. Expression ....................................................................31
2.4. Agarosegel-Elekirophorese
2.4.1. Apparaturen für die Agarosegel-Elektrophorese.................35
2.4.2. Herstellung von Agarosegelen.........................................36
2.4.3. Agarosegel-Elektrophorese .............................................37
2.4.4. Detektion der DNA und
2.4.5. Dekontamination von Ethidiumbromidlösungen..................38
2.5. Automatisierung der PCR (M. Hanke) ...............................39
2.6. DNA-Sequenzierung (U. Reischl, W. Hell)..........................41
2.6.1. Einleitung - Warum wird sequenziert? .............................41
2.6.2. Methoden zur Bestimmung der DNA-Sequenz...................43
2.6.2.1. Maxam-Gilbert-Methode.................................................44
2.6.2.2. Sanger-Methode {Kettenabbruchmethode) ........................44
2.6.2.2.1. Template-DNA...............................................................46
2.6.2.2.2. Sequenzierprimer..........................................................47
2.6.2.2.3. Polyacrylamid-Sequenzgel..............................................48
2.6.2.2.4. DNA-Polymerasen .........................................................49
2.6.3. Sequenzierung von Plasmid-DNA....................................52
2.6.4. Sequenzierung von PCR-Produkten...................................54
2.6.4.1. Klonierung der PCR-Produkte...........................................54
2.6.4.2. Sequenzierung von doppelsträngigen PCR-Produkten .........57
2.6.4.2.1. Asymmetrische PCR .......................................................57
2.6.4.2.2. Festphasen-Sequenzierung..............................................58
2.6.4.2.3. Sequenzierung doppelsträngiger Amplifikations-
produkte ......................................................................59
2.6.5. Detektion der Sequenzierungsprodukte ............................64
2.6.5.1. Radioaktive Markierung und Detektion.............................64
2.6.5.2. Biotin- oder Digoxigenin-Markierung und Detektion ...........65
2.6.5.3. Fluoreszenzmarkierung der Sequenzierungsprodukte .........69
2.6.5.3.1. Dye-Primer Sequenzierung..............................................69
2.6.5.3.2. Dye-Terminator Sequenzierung ........................................71
2.6.5.4. Automatisierte Detektion fluoreszenzmarkierter
Sequenzierungsprodukte ...............,................................71
2.6.6. Ausblicke - Wie kann in Zukunft besser und schneller
sequenziert werden?......................................................72
2.6.6.1.
2.6.6.2. SBH
2.7. Klonierung von PCR-Produkten (M. Hanke) .......................75
2.8.
2.9. Quantitative PCR
2.9.1. Einleitung .....................................................................84
2.9.2. Theorie zur Quantifizierung ............................................84
2.9.3. Der interne Standard .....................................................86
2.9.3.1. Herstellung eines internen Standards................................86
2.9.3.1.
2.9.3.1.2. Mutierter interner Standard.............................................87
2.9.3.1.3. Standard mit
2.9.3.1.4. Genomischer Standard ..................................................88
2.9.3.2. Ko-Amplifikation einer gewebespezifischen Sequenz .........89
2.9.3.3. Komperativer und kompetitiver Ansatz .............................89
2.9.4. Möglichkeiten zur Detektion und Quantifizierung von
PCR-Produkten...............................................................91
2.9.4.1. Direkte Methoden ..........................................................91
2.9.4.1.1. Elektrophoresemethoden ................................................91
2.9.4.1.2. HPLCAnalyse ...............................................................92
2.9.4.2. Indirekte Methoden........................................................95
2.9.5. Wie weit reicht die Quantifizierung? ...............................96
3. Anwendung der PCR im medizinischen und
biologischen Labor
3.
3.1.1. Einleitung .....................................................................97
3.1.2. In Rekordzeit vom Forschungsinstrument zum
anwenderfreundlichen Testkit ..........................................98
3.1.3. Amplicor-Testkits für das klinische Diagnostiklabor ...........104
3.1.4. Nachweis pathogener Keime ........................................112
3.1.4.1. Bakterien ....................................................................
3.1.4.2. Viren .........................................................................125
3.1.4.3. Pilze und Parasiten .......,..............................................132
3.1.4.4. Neu entdeckte Erreger .................................................134
3.1.5. PCR zur Cewebetypisierung .........................................134
3.1.6. PCR in der Onkologie ..................................................136
3.1.6.1. Onkogene Viren..........................................................136
3.1.6.2. Andere Onkogene.......................................................136
3.2. Der Nachweis genetischer Defekte durch PCR
(B. Meurers, H.-P. Vosberg) ...........................................138
3.2.1. Einleitung...................................................................138
3.2.2. Diagnostische Fragestellungen ......................................138
3.2.3. Nachweismethoden .....................................................140
3.2.3.1. Längenanalysen ohne Restriktion ...................................142
3.2.3.2. Längenanalysen mit Restriktion ...............................
3.2.3.3. Heteroduplex-Analysen .........................................
3.2.3.4. Polymorphismen der DNA-Sekundärstrukfur ............;
3.2.3.5. Denaturierungsgradienten.....................................
3.2.3.6. Allel-spezifische Oligonukleotide ...........................
3.2.3.7. Direkte Sequenzierung ..........................................
3.2.3.8. Ein spezieller Gesichtspunkt:
3.2.4. Kopplungsanalyse ...............................................
3.2.5. Schlußbemerkung................................................
3.3. Die Anwendung der PCR für die Diagnose pflanzlich
Krankheitserreger (S. Bereswill, K. Geiderj..............
3.3.1. Einleitung ..........................................................
3.3.2. Ein PCR-Nachweissystem für Erwinia amylovora......
3.3.3 Vorarbeiten .......................................................
3.3.4. Auswahl der Zielsequenz und der Primersequenz ...
3.3.5. Etablierung der optimalen Reaktionsparameter
für die PCR-Amplifikation.....................................
3.3.6. Spezifität des Systems..........................................
3.3.7. PCR-Nachweis von Bakterien aus Flüssigkeiten........
3.3.8. Aufarbeitung von Pflanzenmaterial für die PCR-Anal)
3.3.9. Nachweis von Coronatin-bildenden Pseudomonadet
3.3.10. Die Charakterisierung von E. amylovora und P.
pv. glycinea mit dem PCR^Fingerprinting (RAPD-PC
3.3.11. Vergleich von Nachweismethoden für Erwinia amyk
und Coronatin-bildenden Pseudomonaden.............
3.3.12. Ausblick..............................................................
3.4. Die PCR in der Evolutionsforschung (M. Wink} ........
3.4.1. DNA-Fingerprint-Methoden ..................................
3.4.2. Phylogenie und Systematik ..................................
3.4.2.1. RFLP..................................................................
3.4.2.2. DNA-DNA-Hybridisierung...................................
3.4.2.3. Vergleich der Nukleotidsequenzen von Markergenei
3.4.3. Methodisches Vorgehen......................................
3.4.3.1. DNA-Isolierung..................................................
3.4.3.2. PCR und DNA-Sequenzierung ..............................
3.4.3.3. Primer...............................................................
3.4.3.4. Sequenzierung...................................................
3.4.3.5. Sequenzauswertung...........................................
3.4.4. Exemplarische Ergebnisse ..................................
3.4.4.1. Tiere ...............................................................,
3.4.4.2. Pflanzen............................................................
3.5. RAPD-PCR
3.6. Sortencharakterisierung durch PCR-Methoden am Beispiel
der Weinrebe
3.6.1. Einleitung ...................................................................189
3.6.2. RAPD
3.6.3.
3.6.4.
3.6.5. Varianten de RAPD-PCR................................................196
3.6.5.1.
3.6.5.2. Restriktionen der PCR-Produkte ......................................196
3.6.5.3. Klonierung von PCR-Produkten ......................................196
3.6.5.4. Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte .......196
3.7.
3.8. Charakterisierung klonierter DNA mit PCR
(Insert-Analyse) (M.
3.9. Mutagenese durch PCR (F. Holzinger)..............................211
3.9.1.
3.9.1.1. Mechanismus zur Erzeugung von Punktmutationen...........212
3.9.1.2. Mechanismus zur Erzeugung von Deletionen ..................213
3.9.2. Mutagenese mit 3 Primern ............................................213
3.9.3. Mutagenese mittels
3.9.4. Zufalls-Mutagenese......................................................215
3.10. Amplifikation von
3.10.1. Einleitung ...................................................................216
3.10.2. Besonderheiten von RNA-Polymerasen ...........................216
3.10.3. In vitro Transkription ....................................................217
3.10.4. Verstärkung durch RNA-Replikase..................................220
3.10.5. Verstärkung von
Transkription ...............................................................223
3.10.6. Andere Methoden .......................................................225
3.10.7. Welches Verfahren eignet sich zu welchem Zweck?.........226
3.10.8. Praktische Hinweise .....................................................227
3.10.9. Anhang: Rezepte........................................................228
4. Glossar (M. Kroger) ..................................................229
5. Literatur..................................................................239
6. Produlde für die PCR...........................................27?
7. Index....................,..................................................285
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