Automatisierte Detektion von Proteinphosphorylierung durch Nanoliter‐Enzymreaktionen auf Mikroarrays

Wir beschreiben eine neue, empfindliche Screening‐Methode zur Detektion von Proteinphosphorylierung in komplexen Proteinproben. Der proteolytische Verdau einer Probe wird zuerst mithilfe von nano‐Flüssigchromatographie (nano‐LC) aufgetrennt, das Eluat wird unmittelbar danach hochfrequent in Mikrotröpfchen kompartimentiert und schließlich auf eine Mikroarray‐MALDI‐Platte abgelegt. Nach Aufbringen eines Ölfilms werden pL‐Tröpfchen einer Phosphataselösung zu jeder zweiten Fraktion auf der Mikroarray‐Platte hinzugefügt. Dies induziert in den Fraktionen eine Verschiebung der Massen der phosphorylierten Peptide um n×−80 Da und führt somit zu einem Zickzackprofil des chromatographischen Peaks. Zur Identifizierung wird nun die MALDI‐MS‐Spur der gesamten Trennung von einem Matlab‐Skript auf diese induzierten chromatographischen Peakmuster hin untersucht, wodurch auch Phosphopeptide von sehr geringer Intensität erkannt werden. Die hier vorgestellte Screening‐Methode verwendet keine Peaklisten und es bedarf auch keiner umfangreichen MS/MS‐Experimente. Informative Spaltung: Eine Massenspektrometrie‐basierte Screening‐Methode ermöglicht die Detektion von Proteinphosphorylierungen in komplexen Proteinmischungen. Die Methode nutzt Tropfen‐Mikrofluidik, um nL‐Phosphatase‐Reaktionen auf einer Mikroarray‐MALDI‐Platte durchzuführen. Die enzymatische Dephosphorylierung jeder zweiten LC‐Fraktion induziert dabei Fluktuationen in den Peaks von Phosphopeptiden, anhand derer sie leicht identifiziert werden können.