从外周血单个核细胞中获得内皮祖细胞的方法学研究

R54%Q2-33; 目的 探讨从成人外周血单个核细胞中分离、培养内皮祖细胞(EPCs)的方法以及EPCs的生物学特征.方法 密度梯度离心法获得单个核细胞(MNCs),用含生长因子的内皮培养基接种于纤连蛋白包被的培养板中.分别采用常规方法(A组)和序列黏附法(B组)培养,A组细胞于接种第4天洗去未黏附细胞然后隔日换液1次;B组细胞接种后每2 h去除1次未黏附细胞,共2次.两组细胞均在7 d后计数早期克隆,持续培养直到晚期克隆出现.流式细胞技术检测细胞表面抗原表达,直接荧光染色法测定细胞结合荆豆凝集素及摄取乙酰化低密度脂蛋白,胶原凝胶细胞种植实验测定体外血管生成功能.结果 早期克隆数目的 获得在2组间差异有统计学意义,但序列黏附法获得晚期克隆数目显著增加(P＜0.05),且B组的早期克隆细胞表达CD3显著减少(P＜0.05).晚期克隆形态不同于早期克隆,在培养21～28 d出现,其组成细胞与早期克隆相比CD45、CD14表达显著减少(P＜0.001)而CD146表达明显增加(P＜0.01),只有晚期克隆再种植可形成第二代内皮细胞克隆,并具有体外血管生成功能.两种克隆的构成细胞在结合植物凝集素和摄取乙酰化低密度脂蛋白方面差异无统计学意义.结论 人外周血单个核细胞在内皮培养条件下可形成早期克隆和晚期克隆,早期克隆属于单核细胞系列,无内皮分化功能;晚期克隆细胞具有EPCs的形态和生物学特征,应用序列黏附法可显著提高晚期克隆获得率.