枸橼C-05 CmPR4A上游转录因子CmWRKY75的筛选及其抗溃疡病功能分析

[背景]柑橘溃疡病(Citrus canker)是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)引起的危害严重的柑橘病害之一,目前尚无根治方法,而现有栽培品种中很少有对柑橘溃疡病存在显著抗性的品种,因此,抗病品种的选育对根治该病害尤其重要,而抗性基因的发掘又非常利于抗病育种.[目的]以枸橼 C-05 的抗溃疡病相关基因CmPR4A为诱饵,筛选其上游转录因子,探究转录因子参与调控枸橼C-05抗溃疡病的功能作用,为选育柑橘抗病品种提供基因信息.[方法]基于前期冰糖橙和枸橼C-05叶片接种Xcc的转录组测序结果,结合实时荧光定量PCR分析PR4A在抗病和感病种质中的表达差异,使用PlantCARE对枸橼C-05(抗病)和冰糖橙(感病)PR4A启动子序列进行差异分析,利用酵母单杂交筛选PR4A上游转录因子,并使用酵母回转验证、双荧光素酶验证CmPR4A和候选转录因子的互作关系.在 8 种抗病和感病柑橘种质中,人工接种Xcc后,于 0、2、4、6 和 8 d时取注射点附近的叶片,对转录因子的表达水平进行分析,验证其与抗病的关系.通过农杆菌介导瞬时转化法,将带有 35S启动子的转录因子载体在枸橼C-05 和冰糖橙叶片中瞬时过表达,使用qRT-PCR对转录因子和PR4A表达水平进行分析,并在瞬时过表达24 h后接种Xcc,进行Xcc菌定量和症状观察.[结果]接种Xcc的枸橼C-05和冰糖橙的转录组分析及定量PCR表达结果显示,在接种4、6 和 8 d时,抗病种质枸橼C-05 中的PR4A表达量显著高于感病的冰糖橙.枸橼C-05和冰糖橙的PR4A启动子在-236 bp处存在顺式作用元件W-box的差异,以此为依据进行CmPR4A启动子短截并构建诱饵载体.依据自激活结果,在200 ng·mL-1的金担子素(AbA)浓度下,以proCmPR4A-2为诱饵,在枸橼C-05受Xcc诱导下的酵母文库中进行酵母单杂交筛选,表明CmWRKY75 可以与proCmPR4A-2互作,双荧光素酶报告系统也证实二者的互作关系,且CmWRKY75正调控CmPR4A的表达.在8种柑橘种质叶片接种Xcc后进行WRKY75的表达模式分析表明,WRKY75表达量在抗病种质枸橼C-05、美国枸橼AV、矮果香橼中显著上调,在感病种质冰糖橙、沙田柚及柠檬、南川香橼和丹娜香橼中只出现微量上调.在枸橼C-05和冰糖橙叶片中