佛波酯诱导THP-1细胞分化条件的优化及自噬模型的建立

目的 探讨佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）诱导THP-1细胞（人类单核/巨噬细胞）分化的最优条件，建立相关自噬模型，为基于细胞自噬模型的研究奠定实验基础。 方法 采用PMA诱导THP-1细胞分化成巨噬细胞；用表达融合蛋白pcDNA3.1-YFP-LC3质粒转染THP-1细胞，YFP为黄绿色荧光蛋白，以示踪自噬体的形成。采用倒置显微镜观察不同浓度（0、10、20、50、100、200 ng/ml）、不同时间（0、24、48、60 h）PMA分化细胞形态学变化；采用荧光显微镜示踪不同条件下LC3点聚集的增强；实时荧光定量聚合酶链式反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction ，RT-qPCR）检测自噬相关基因mRNA的表达。采用SPSS 17.0软件进行统计分析。mRNA相对含量2-ΔΔCt用“x±s”表示。经比较Ct值法分析基因表达差异。Earle’s balanced salts solution（EBSS，又称饥饿培养基），诱导细胞自噬相关基因mRNA表达量变化的比较采用t检验分析，以P0.05为差异有统计学意义。 结果 PMA浓度为100 ng/ml、诱导时间为24～48 h时，THP-1细胞分化成巨噬细胞的形态学状态较理想。饥饿培养基EBSS处理分化的THP-1细胞，能增加自噬体YFP-LC3点聚集，其自噬相关基因LC3、Atg5、Atg7、Beclin1的mRNA表达水平显著增加 （2-ΔΔCt均值分别为1.35±0.16、1.18±0.39、1.44±0.12、1.08±0.09，t值分别为4.00、2.90、5.16、3.57，P值均＜0.05）。 结论 PMA在浓度为100 ng/ml、24～48 h时诱导THP-1分化为巨噬细胞状态较理想；成功构建了THP-1源性细胞自噬模型。