Aufklärung der Interaktion zwischen dem humanen Prionprotein und dem peptidischen Aggregationsinhibitor NMHRYPNQ

Der Erreger der Transmissiblen spongiformen Enzephalopathien ist das Prionprotein (PrP), das in zwei verschiedenen Konformationen vorkommt. Für die Konformationsänderung des zellulären PrPC in das pathogene PrPSc wird die Interaktion der beiden Proteinkonformere angenommen. Die Inhibition dieser Wechselwirkung oder die Stabilisierung des PrPC ist ein möglicher Ansatzpunkt für Therapeutika. Für das Peptid 153NMHRYPNQ160 (1) konnte in einem in vitro Assay eine solche Stabilisierung der PrPC Konformation nachgewiesen werden. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, die Bindungsinteraktion zwischen dem Peptid 1 und dem humanen Prionprotein genauer zu charakterisieren. Hierfür wurden 1H,15N-HSQC NMR-Experimente mit dem 15N-markierten hPrP(90-230) durchgeführt. Der Vergleich der chemischen Verschiebungen der Amidsignale bei An- und Abwesenheit des Peptids 1 lieferte zwei mögliche Bindungsregionen des Peptids auf dem Protein. Die erste Bindungsregion befindet sich am Ende der Helix-1, während die zweite Region im Bereich der Helix-3 lokalisiert ist. Eine Bestätigung wurde durch MALDI-TOF-MS H/D Austauschexperimente, in denen die Deuteriumeinbaurate einzelner Proteinfragmente in An- und Abwesenheit des Peptids 1 verglichen wurde, erreicht. Die Anwesenheit des Peptids 1 führte zu einer Verringerung der Einbaurate für Fragmente aus dem Bereich der Helix-3, wodurch diese als Bindungsregion bestätigt wurde. Für die Bestimmung des Bindungsepitops seitens des Liganden wurde zunächst ein Alaninscan der Peptide 1 und 18 (149YYRENMHR156) durchgeführt und die Bindungseigenschaften mittels SPR-Experimenten bestimmt. Die Bindungskonstanten dieser Peptide variierten zwischen KD = 29 µM für das Peptid 153NMHRYANQ160 (15) und 4880 µM für das Peptid 149YYREAMHR156 (6). Der Vergleich aller erhaltenen Bindungskonstanten lieferte ein erstes Bindungsepitop, welches, mit Ausnahme des Pro158, die gesamte Sequenz des Peptids NMHRYPNQ umfasste. Für die Erstellung des Bindungsepitops auf atomarer Ebene wurden STD NMR-Experimente mit dem Peptid 153NAHRYPNQ160 (11) durchgeführt. Das Asn153 und das Tyr157 tragen hiernach nur in geringen Umfang zur Bindung bei, während für das Arg156 und das Glu160 starke STD-Prozente bestimmt werden konnten und somit einen großen Beitrag zu der Bindung aufweisen müssen. Obwohl bei der Substitution des Pro158 gegen Alanin kein Effekt auf die Bindungsstärke beobachtet werden konnte, wird vergleichsmäßig viel Sättigung auf die Protonen dieses Prolins übertragen, so