Caracterización cinética de la PfAM1 recombinante, una aminopeptidasa M1 de Plasmodium falciparum , con sustratos peptídicos fiuorogénicos

La aminopeptidasa M1 neutra de Plasmodium falciparum (PfAM1) es un blanco validado contra la malaria, la principal enfermedad parasitaria humana en las regiones tropicales. Recientemente, nuestro grupo obtuvo una variante recombinante de esta enzima (PfAM1r) con un rendimiento de 24 mg de proteína activa por L de cultivo. Para confirmar la conveniencia de esta aminopeptidasa recombinante como blanco para la identificación de nuevos inhibidores potentes y selectivos de la enzima endógena, y para ajustar los parámetros experimentales de los ensayos de inhibición, en este trabajo se determinaron las principales características cinéticas de la PfAM1r frente a sustratos fluorogénicos conjugados L-aminoacil-7-amida-4-metilcumarina (AMC). En primer lugar, el catión [Zn.sup.2+] inhibió la actividad de la PfAM1r a concentraciones > 1 [micrón]mol/L, un efecto análogo cualitativamente al observado para otras aminopeptidasas de tipo metalo. En correspondencia con informes anteriores, el pH cercano al neutro (7,2-7,4) es el óptimo con los 4 sustratos evaluados (Ala-, Leu-, Met- y Arg-AMC). Los valores de [K.sub.M] al pH 7,2 (Met-AMC: 23 [+ ó -] 5 [micrón]mol/L; Arg-AMC: 37 [+ ó -] 4 [micrón]mol/L; Ala-AMC: 106 [+ ó -] 9 [micrón]mol/L; Leu-AMC: 60 [+ ó -] 7 [micrón]mol/L) son más cercanos a los informados previamente para la enzima nativa que los obtenidos por otro grupo de autores con otra PfAM1 recombinante. Por otra parte, los valores de kcat obtenidos en este trabajo a pH 7,2 (Met-AMC: 99 [+ ó -] 9 [s.sup.-1]; Arg-AMC: 129 [+ ó -] 6 [s.sup.-1]; Ala-AMC: 268 [+ ó -] 20 [s.sup.-1]; Leu-AMC: 79 [+ ó -] 6 [s.sup.-1]) son los mayores informados hasta ahora para la PfAM1, lo que indica que la preparación enzimática obtenida es particularmente activa. La disminución del pH de 7,2 a 5,2, afectó más la eficiencia catalítica de la PfAM1r que la afinidad frente a la Leu-, Met- y Arg-AMC. El efecto contrario se observó con la Ala-AMC. Los parámetros cinéticos a valores de pH cercanos al neutro variaron en función de la identidad del residuo amino terminal del sustrato, de manera similar a lo informado por otro grupo, los que utilizaron una tercera PfAM1 recombinante y sustratos dipéptidos naturales. Finalmente, la PfAM1r no resultó sensible a los inhibidores PMSF, E64 y pepstatina A, pero se inhibió por la amastatina, la 1,10-fenantrolina y la bestatina. Este es un perfil de inhibición típico de aminopeptidasas de tipo metalo neutras y básicas, informado también para la PfAM1 n