Method of isolation and initiation of in vitro culture of microspores using early-medium to medium stage in spring barley

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób izolacji i inicjacji kultury in vitro mikrospor z wykorzystaniem stadium wczesno-średniego do średniego jęczmienia jarego, który polega na tym, że świeżo ścięte kłosy tnie się na ok. 1 cm fragmenty i umieszcza się w schłodzonej komorze blendera. Kłosy blenduje się dwukrotnie w 0,4 M mannitolu przy wolnych obrotach. Zblendowane kłosy przepuszcza się przez 100 µm sterylny filtr do pojemnika znajdującego się na lodzie. Resztki kłosów zbiera się z filtra i blenduje dwukrotnie w 0,4 M mannitolu w celu uwolnienia jak największej liczby mikrospor i ponownie filtruje przez 100 µm filtr. Zawiesinę mikrospor przelewa się do probówki i wiruje przy 120 - 130 x g przez 8 - 10 min w temperaturze 4°C następnie usuwa się supernatant a osad mikrospor zawiesza się w 0,55 M maltozy. Zawiesinę przenosi się do nowej sterylnej probówki i na powierzchnię nanosi się 0,4 M mannitol i wiruje w gradiencie stężeń przy 100 - 110 x g przez 8 - 10 min w temperaturze 4°C w celu oddzielenia mikrospor żywotnych, znajdujących się na granicy faz, od nieżywotnych znajdujących się w pelecie. Mikrospory znajdujące się na granicy faz w pierścieniu zbiera się i wiruje w celu ich osadzenia przy 120 - 130 x g przez 8 - 10 min w temperaturze 4°C. Następnie osusza się osad mikrospor, a mikrospory zawiesza się w pożywce SMB1 do gęstości 100 000 - 150 000 mikrospor na 1 ml pożywki wyłożone na szalkę i inkubuje się korzystnie przez 48 h w temperaturze 25°C. Następnie pożywkę SMB1 wymienia się na pożywkę KBP zmodyfikowaną poprzez dodanie hydrolizatu kazeiny i kwasów organicznych do gęstości 100 000 - 150 000 mikrospor na 1 ml pożywki wyłożone na szalkę. Kulturę in vitro na zmodfikowanej pożywce KBP prowadzi się przez 7 dni w temperaturze 25°C w ciemności. Po tym czasie dodaje się świeżej pożywki KBP i kulturę kontynuuje się przez 2 tygodnie w tych samych warunkach z wytrząsaniem przy 100 rpm. Następnie usuwa się pożywkę KBP, a umorzone struktury wielokomórkowe przenosi się na pożywkę różnicującą KBPD na filtry bibułowe. Kulturę prowadzi się w temperaturze 25°C w ciemności przez 2 tygodnie. Po tym czasie struktury wielokomórkowe przenosi się na pożywkę regenerującą K4NB, a kulturę prowadzi się w tych samych warunkach przez 5 dni i następnie przenosi na światło przy 16 h fotoperiodzie w temperaturze 24°C. Z kultury zregenerowane zielone rośliny przekłada się na świeżą pożywkę K4NB celem ich wzrostu i gdy korzeń jest rozwinięty rośliny przenosi się do ziemi.