家蚕bHLH转录因子Bmdimm与Bmchip的相互作用

【目的】bHLH转录因子Bmdimm是家蚕（Bombyx mori）5龄后期调控蚕丝蛋白丝素重链基因表达的重要转录因子。分析发现Bmdimm蛋白中包含有可能发生泛素化修饰的赖氨酸残基K43,因此推测Bmdimm可能发生泛素化修饰而被降解。Bmchip属于家蚕泛素连接酶E3家族中的U-box亚家族,在家蚕5龄期后部丝腺中有表达。论文旨在明确Bmdimm与Bmchip之间的相互作用,以便于更好地理解Bmdimm在家蚕体内的泛素化修饰及其对丝素重链基因转录调控的生物学意义。【方法】利用家蚕各组织基因芯片表达谱分析Bmdimm和Bmchip在后部丝腺中的表达情况;分别通过PCR和基因合成获得Bmdimm和Bmchip的CDS序列,将其构建到不同的原核表达载体并转化大肠杆菌表达目的蛋白,筛选最优的表达条件;利用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,加入蛋白酶酶切,并再次通过镍柱亲和层析去除融合标签,纯化Bmdimm和Bmchip蛋白;利用凝胶过滤层析分析Bmdimm和Bmchip在溶液中的聚集状态;利用圆二色光谱研究Bmdimm和Bmchip蛋白的二级结构;利用Far-western blotting和Pull-down研究Bmdimm和Bmchip在体外的相互作用;利用微量热泳动研究Bmdimm和Bmchip结合的亲和力。【结果】基因芯片表达谱揭示Bmdimm和Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中都有表达。构建了Bmdimm和Bmchip多种表达载体,发现ppSUMO-Bmdimm和pET-32M·3C-Bmchip表达载体在16℃,0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导下表达最好,并以此为基础表达纯化了Bmdimm和Bmchip蛋白;凝胶过滤分析表明Bmdimm和Bmchip蛋白在溶液中主要以二聚体的形式存在;圆二色光谱显示Bmdimm和Bmchip蛋白都含有α-螺旋结构;Far-western blotting和Pull-down结果表明Bmdimm和Bmchip可以在体外结合;利用微量热泳动实验计算出Bmdimm和Bmchip结合的平衡解离常数为（750±28.6）μmol·L^-1。【结论】家蚕bHLH转录因子Bmdimm和泛素连接酶Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中均有表达,二者可以在体外发生瞬时相互作用,暗示了Bmdimm可能通过Bmchip介导发生泛素化修饰从而下调丝素重链基因的转录。