同时检测豇豆花叶病毒属与蚕豆病毒属病毒的通用RT-PCR检测方法

【目的】建立一个可同时检测豇豆花叶病毒属（Comovirus）和蚕豆病毒属（Fabavirus）病毒的通用RT-PCR检测方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析,在其保守区域设计简并引物,用于这2个病毒属病毒的通用RT-PCR检测,并进行灵敏性、特异性试验。为便于PCR产物直接测序,在简并引物中引入通用测序引物（RV-M和M13-47）,并通过序列分析对病毒种类鉴定。利用该方法对来自福建柘荣的太子参病毒进行检测验证。【结果】设计一对简并引物,建立了一个用于扩增豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒部分依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）基因的通用RT-PCR方法。该方法成功用于检测安第斯马铃薯斑驳病毒（ApMoV）、蚕豆染色病毒（BBSV）、蚕豆真花叶病毒（BBTMV）、菜豆荚斑驳病毒（BPMV）、豇豆花叶病毒（CPMV）、豇豆重花叶病毒（CPSMV）、南瓜花叶病毒（SqMV）、红三叶草斑驳病毒（RCMV）和萝卜花叶病毒（RaMV）9种豇豆花叶病毒属病毒;蚕豆萎蔫病毒1号（BBWV1）、蚕豆萎蔫病毒2号（BBWV2）2种蚕豆病毒属病毒共计17个分离物,而不能与同亚科的线虫传多面体病毒属病毒及健康寄主植物反应,显示出良好的广谱性和特异性。在简并引物的5′端分别加入一段非互补的通用测序引物序列（RV-M和M13-47）,不仅可以利用该通用测序引物进行PCR产物直接测序,而且检测灵敏度可以提高10—100倍。序列及系统发育分析表明,所扩增的序列可以把豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒区分到种的水平。利用该方法测定了BBSV的部分RdRp基因序列,显示出与RCMV具有最近的亲缘关系。利用该方法在太子参中检出BBWV2。【结论】建立的通用RT-PCR方法可用于豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒的广谱性检测,结合序列可进行病毒种类的快速鉴定,并且可能用于新病毒种类的检测鉴定。