Enabling and optimizing cell-free systems for synthetic biology applications

L'objectif de cette thèse est de couvrir trois facettes de la recherche sur les technologies cell-free, à savoir : i. l'utilisation de la technologie cell-free à des fins d'ingénierie métabolique, ii. les procédés de stabilisation d'ADN linéaire dans un environnement cell-free et iii. l'optimisation de l'expression des protéines dans les systèmes cell-free. La section I présente la tentative de biosynthèse de deux métabolites végétaux d'intérêt industriel, la Pinocembrine et le Sinapoyl-Malate. Pour évaluer le prototypage de l'ingénierie des voies, la quantification de ces molécules pourrait être vérifiée par biodétection. Dans cette thèse, une Pinocembrine validée en laboratoire in vivo a été testée ainsi que 3 nouveaux biocapteurs différents pour le Sinapoyl-Malate. Dans la section II, l'utilisation de l'ADN linéaire pourrait potentiellement accélérer le prototypage des nouvelles constructions génétiques, indépendamment des étapes de clonage. Pour cela 2 stratégies ont été mises en place pour stabiliser l'ADN : à partir de la circularisation in vitro de l'ADN linéaire en dumbbell-DNA ou en concatémères circulaires.De plus, des souches d'E. coli ont été génétiquement modifiées pour créer lysats des mutants d'exonucléase d'ADN linéaire, ∆recB et ∆recBCD . Une fois que le tampon a été caractérisé individuellement pour le type d'ADN, l'ADN linéaire montre une expression comparable à l'ADN plasmidique. La section III aborde l'optimisation de la synthèse des protéines en utilisant des séquences de ribozymes pour circulariser et par conséquent prolonger le turnover des produits de mARN. Une fois que le mARN circulaire est plus résistant aux nucléases, l'expression des protéines est augmentée. De plus, la composition du tampon d'expression en cell-free a été méticuleusement améliorée pour le rendement global en protéines grâce à une approche d'Active Learning. Cette amélioration a conduit à une réduction considérable des variations de type batch-to-batch. Globalement, cette thèse démontre l'ingéniosité de l'amélioration des systèmes cell-free et ses différentes applications potentielles en biologie synthétique. The aim of the thesis covers three facets of cell-free technology research, i. the use of the cell-free technology for metabolic engineering purposes, ii. methods for stabilizing linear DNA in a cell-free environment and iii. the optimization of protein expression in cell-free systems. The section I showcases the attempt of biosynthesis of two plant metab