Étude des mécanismes d'action expliquant les différences phénotypiques entre les mutants de la calréticuline del52 et ins5 dans les néoplasmes myéloprolifératifs
Les néoplasmes myéloprolifératifs classiques (NMP) sont maladies malignes clonales de la cellule souche hématopoïétique (CSH) caractérisées par la production exagérée des cellules matures du sang : les plaquettes dans la thrombocytémie essentielle (TE), les globules rouges dans la polyglobulie de Va...
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Classical myeloproliferative neoplasms (MPNs) are clonal malignant diseases of the hematopoietic stem cell (HSC) characterized by the exaggerated production of mature blood cells: platelets in essential thrombocythemia (ET), red blood cells in polycythemia Vera (PV), and granules in primary myelofibrosis (PMF) also associated with bone marrow (BM) megakaryocyte (MK) hyperplasia and the disabling presence of collagen fibers. Myelofibrosis (MF) is the most severe and heterogeneous form of MPN. In many cases, these diseases progress to leukemia. MPNs are due to the acquisition of gain-of-function mutations affecting the JAK2 kinase, calreticulin (CALR) and the thrombopoietin receptor (TPO) MPL. These mutations lead to constitutive activation of JAK2/STAT signaling downstream of cytokine receptors and uncontrolled myeloid proliferation. Mutations in CALR (CALRmut) are associated with approximately 30% of ETs and PMFs. Two types of CALRmut are more frequent, CALRdel52 and CALRins5 are found in ET, while CALRdel52 is predominant in MFP. The goal of my thesis project is to understand the basis of the phenotypic differences induced by the two types of CALRmut, CALRdel52 and CALRins5, using knock-in (KI) mouse models generated in the laboratory. These mice express murine CALRdel52 and CALRins5 with the human mutated C-terminal tail. Comparative study of the hematopoiesis of KI CALRdel52 and KI CALRins5 mice showed that CALRdel52 mice develop a more severe phenotype than KI CALRins5 mice in terms of thrombocytosis and progression to MF, and in homozygous than heterozygous context. HSC amplification and competitive advantage, as well as MK amplification, are most prominent in the CALRdel52 homozygous context. The phenotype of heterozygous CALRins5 is almost indistinguishable from that of controls, whereas heterozygous CALRdel52 develop intermediate disease. Although these mice globally mimic human disease with a more severe effect of CALRdel52 compared to CALRins5, we observed more moderate phenotypes than patients in terms of thrombocytosis and progression to myelofibrosis, particularly for heterozygous mice. We demonstrated that the human/mouse differences were due to suboptimal activation of the JAK2/STAT5 pathway by murine MPL compared to human MPL regardless of mutants (in vitro luciferase assays). Furthermore, using a competitive grafting (2:8) between CALRins5 homozygous and CALRins5 heterozygous clones we found that homozygosity, more often observed in CALRins5 than CALRdel52 patients, plays a key role in the severity of thrombocytosis and allows to reach or exceed CALRdel52 induced thrombocytosis (Benlabiod et al., 2020). The second part of my work focused on investigating the mechanisms that explain the difference in phenotype between these two mutants. Using flow cytometry analysis, it was observed that CALRdel52 homozygous HSCs divide more than CALRins5 homozygous HSCs. In parallel, I could observe a different signaling between the two mutant HSCs by mass cytometry. Indeed, CALRdel52 HSCs express more strongly p-EIF2a which is an actor of the endoplasmic reticulum stress response. scRNA-seq results are currently being analyzed and should allow us to understand more fully the phenotypic differences observed between these two mutants.</description><language>fre</language><subject>Calreticulin ; Calréticuline ; Cellule souche hématopoïétique ; Hematopoietic stem cell ; Knock-In mouse model ; Megakaryocyte ; Modèle de souris knock-In ; Myeloproliferative neoplasms ; Mégakaryocyte ; Néoplasmes myéloprolifératifs</subject><creationdate>2022</creationdate><oa>free_for_read</oa><woscitedreferencessubscribed>false</woscitedreferencessubscribed></display><links><openurl>$$Topenurl_article</openurl><openurlfulltext>$$Topenurlfull_article</openurlfulltext><thumbnail>$$Tsyndetics_thumb_exl</thumbnail><link.rule.ids>230,311,780,885,26981</link.rule.ids><linktorsrc>$$Uhttps://www.theses.fr/2022UNIP5113/document$$EView_record_in_ABES$$FView_record_in_$$GABES$$Hfree_for_read</linktorsrc></links><search><creatorcontrib>Benlabiod, Camélia</creatorcontrib><title>Étude des mécanismes d'action expliquant les différences phénotypiques entre les mutants de la calréticuline del52 et ins5 dans les néoplasmes myéloprolifératifs</title><description>Les néoplasmes myéloprolifératifs classiques (NMP) sont maladies malignes clonales de la cellule souche hématopoïétique (CSH) caractérisées par la production exagérée des cellules matures du sang : les plaquettes dans la thrombocytémie essentielle (TE), les globules rouges dans la polyglobulie de Vaquez (PV) et les granuleux dans la myélofibrose primaire (MFP) également associée à une hyperplasie des mégacaryocytes (MK) de la moelle osseuse (Mo) et à la présence invalidante de fibres de collagène. La myélofibrose (MF) est la forme la plus sévère et hétérogène des NMP. Ces maladies évoluent dans de nombreux cas vers des leucémies. Les NMP sont dus à l'acquisition de mutations gain-de-fonction affectant la kinase JAK2, la calréticuline (CALR) et le récepteur à la thrombopoïétine (TPO) MPL. Ces mutations conduisent à l'activation constitutive de la signalisation JAK2/STAT en aval des récepteurs des cytokines et à une prolifération myéloïde incontrôlée. Les mutations de CALR (CALRmut) sont associées à environ 30% des TE et des MFP. Deux types de CALRmut sont plus fréquentes, CALRdel52 et CALRins5 sont trouvées dans la TE, tandis que CALRdel52 est prédominante dans la MFP. Le but du mon projet de thèse est de comprendre les bases des différences phénotypiques induites par les deux types de CALRmut, CALRdel52 et CALRins5, à l'aide de modèles de souris knock-in (KI) générées dans le laboratoire. Ces souris expriment les CALRdel52 et CALRins5 murines avec la queue C-terminale mutée humaine. L'étude comparative de l'hématopoïèse des souris KI CALRdel52 et KI CALRins5 a montré que les souris CALRdel52 développent un phénotype plus sévère que les souris KI CALRins5 en termes de thrombocytose et de progression en MF, et en contexte homozygote qu'hétérozygote. L'amplification et l'avantage compétitif des CSH, ainsi que l'amplification des MK, sont les plus importants dans le contexte homozygote CALRdel52. Le phénotype des hétérozygotes CALRins5 est presque indiscernable de celui des contrôles, tandis que les hétérozygotes CALRdel52 développent une maladie intermédiaire. Mêmes si ces souris miment globalement la maladie humaine avec un effet plus sévère de la CALRdel52 comparé à la CALRins5, nous avons observé des phénotypes plus modérés que chez les patients en termes de thrombocytose et de progression en myélofibrose, particulièrement pour les souris hétérozygotes. Nous avons démontré que les différences homme/souris étaient dues à une activation suboptimale de la voie JAK2/STAT5 par le MPL murin par rapport au MPL humain quelques soit les mutants (tests de luciférase in vitro). De plus, à l'aide d'une greffe compétitive (2:8) entre des clones homozygotes CALRins5 et des clones hétérozygotes CALRins5 nous avons trouvé que l'homozygotie, plus souvent observée chez les patients CALRins5 que CALRdel52, joue un rôle essentiel dans la sévérité de la thrombocytose et permet d'atteindre ou de dépasser la thrombocytose induite par CALRdel52 (Benlabiod et al., 2020). La deuxième partie de mon travail s'est concentrée sur l'étude des mécanismes permettant d'expliquer la différence de phénotype entre ces deux mutants. Grâce à des analyses par cytométrie en flux, il a été observé que les CSH CALRdel52 homozygotes se divisent plus que les CSH homozygotes CALRins5. En parallèle, j'ai pu observer une signalisation différente entre les CSH deux mutants par cytométrie de masse. En effet, les CSH CALRdel52 expriment plus fortement p-EIF2a qui est un acteur de la réponse au stress du réticulum endoplasmique. Des résultats de scRNA-seq sont actuellement en cours d'analyse et devraient nous permettre de comprendre plus amplement les différences phénotypiques observées entre ces deux mutants.
Classical myeloproliferative neoplasms (MPNs) are clonal malignant diseases of the hematopoietic stem cell (HSC) characterized by the exaggerated production of mature blood cells: platelets in essential thrombocythemia (ET), red blood cells in polycythemia Vera (PV), and granules in primary myelofibrosis (PMF) also associated with bone marrow (BM) megakaryocyte (MK) hyperplasia and the disabling presence of collagen fibers. Myelofibrosis (MF) is the most severe and heterogeneous form of MPN. In many cases, these diseases progress to leukemia. MPNs are due to the acquisition of gain-of-function mutations affecting the JAK2 kinase, calreticulin (CALR) and the thrombopoietin receptor (TPO) MPL. These mutations lead to constitutive activation of JAK2/STAT signaling downstream of cytokine receptors and uncontrolled myeloid proliferation. Mutations in CALR (CALRmut) are associated with approximately 30% of ETs and PMFs. Two types of CALRmut are more frequent, CALRdel52 and CALRins5 are found in ET, while CALRdel52 is predominant in MFP. The goal of my thesis project is to understand the basis of the phenotypic differences induced by the two types of CALRmut, CALRdel52 and CALRins5, using knock-in (KI) mouse models generated in the laboratory. These mice express murine CALRdel52 and CALRins5 with the human mutated C-terminal tail. Comparative study of the hematopoiesis of KI CALRdel52 and KI CALRins5 mice showed that CALRdel52 mice develop a more severe phenotype than KI CALRins5 mice in terms of thrombocytosis and progression to MF, and in homozygous than heterozygous context. HSC amplification and competitive advantage, as well as MK amplification, are most prominent in the CALRdel52 homozygous context. The phenotype of heterozygous CALRins5 is almost indistinguishable from that of controls, whereas heterozygous CALRdel52 develop intermediate disease. Although these mice globally mimic human disease with a more severe effect of CALRdel52 compared to CALRins5, we observed more moderate phenotypes than patients in terms of thrombocytosis and progression to myelofibrosis, particularly for heterozygous mice. We demonstrated that the human/mouse differences were due to suboptimal activation of the JAK2/STAT5 pathway by murine MPL compared to human MPL regardless of mutants (in vitro luciferase assays). Furthermore, using a competitive grafting (2:8) between CALRins5 homozygous and CALRins5 heterozygous clones we found that homozygosity, more often observed in CALRins5 than CALRdel52 patients, plays a key role in the severity of thrombocytosis and allows to reach or exceed CALRdel52 induced thrombocytosis (Benlabiod et al., 2020). The second part of my work focused on investigating the mechanisms that explain the difference in phenotype between these two mutants. Using flow cytometry analysis, it was observed that CALRdel52 homozygous HSCs divide more than CALRins5 homozygous HSCs. In parallel, I could observe a different signaling between the two mutant HSCs by mass cytometry. 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La myélofibrose (MF) est la forme la plus sévère et hétérogène des NMP. Ces maladies évoluent dans de nombreux cas vers des leucémies. Les NMP sont dus à l'acquisition de mutations gain-de-fonction affectant la kinase JAK2, la calréticuline (CALR) et le récepteur à la thrombopoïétine (TPO) MPL. Ces mutations conduisent à l'activation constitutive de la signalisation JAK2/STAT en aval des récepteurs des cytokines et à une prolifération myéloïde incontrôlée. Les mutations de CALR (CALRmut) sont associées à environ 30% des TE et des MFP. Deux types de CALRmut sont plus fréquentes, CALRdel52 et CALRins5 sont trouvées dans la TE, tandis que CALRdel52 est prédominante dans la MFP. Le but du mon projet de thèse est de comprendre les bases des différences phénotypiques induites par les deux types de CALRmut, CALRdel52 et CALRins5, à l'aide de modèles de souris knock-in (KI) générées dans le laboratoire. Ces souris expriment les CALRdel52 et CALRins5 murines avec la queue C-terminale mutée humaine. L'étude comparative de l'hématopoïèse des souris KI CALRdel52 et KI CALRins5 a montré que les souris CALRdel52 développent un phénotype plus sévère que les souris KI CALRins5 en termes de thrombocytose et de progression en MF, et en contexte homozygote qu'hétérozygote. L'amplification et l'avantage compétitif des CSH, ainsi que l'amplification des MK, sont les plus importants dans le contexte homozygote CALRdel52. Le phénotype des hétérozygotes CALRins5 est presque indiscernable de celui des contrôles, tandis que les hétérozygotes CALRdel52 développent une maladie intermédiaire. Mêmes si ces souris miment globalement la maladie humaine avec un effet plus sévère de la CALRdel52 comparé à la CALRins5, nous avons observé des phénotypes plus modérés que chez les patients en termes de thrombocytose et de progression en myélofibrose, particulièrement pour les souris hétérozygotes. Nous avons démontré que les différences homme/souris étaient dues à une activation suboptimale de la voie JAK2/STAT5 par le MPL murin par rapport au MPL humain quelques soit les mutants (tests de luciférase in vitro). De plus, à l'aide d'une greffe compétitive (2:8) entre des clones homozygotes CALRins5 et des clones hétérozygotes CALRins5 nous avons trouvé que l'homozygotie, plus souvent observée chez les patients CALRins5 que CALRdel52, joue un rôle essentiel dans la sévérité de la thrombocytose et permet d'atteindre ou de dépasser la thrombocytose induite par CALRdel52 (Benlabiod et al., 2020). La deuxième partie de mon travail s'est concentrée sur l'étude des mécanismes permettant d'expliquer la différence de phénotype entre ces deux mutants. Grâce à des analyses par cytométrie en flux, il a été observé que les CSH CALRdel52 homozygotes se divisent plus que les CSH homozygotes CALRins5. En parallèle, j'ai pu observer une signalisation différente entre les CSH deux mutants par cytométrie de masse. En effet, les CSH CALRdel52 expriment plus fortement p-EIF2a qui est un acteur de la réponse au stress du réticulum endoplasmique. Des résultats de scRNA-seq sont actuellement en cours d'analyse et devraient nous permettre de comprendre plus amplement les différences phénotypiques observées entre ces deux mutants.
Classical myeloproliferative neoplasms (MPNs) are clonal malignant diseases of the hematopoietic stem cell (HSC) characterized by the exaggerated production of mature blood cells: platelets in essential thrombocythemia (ET), red blood cells in polycythemia Vera (PV), and granules in primary myelofibrosis (PMF) also associated with bone marrow (BM) megakaryocyte (MK) hyperplasia and the disabling presence of collagen fibers. Myelofibrosis (MF) is the most severe and heterogeneous form of MPN. In many cases, these diseases progress to leukemia. MPNs are due to the acquisition of gain-of-function mutations affecting the JAK2 kinase, calreticulin (CALR) and the thrombopoietin receptor (TPO) MPL. These mutations lead to constitutive activation of JAK2/STAT signaling downstream of cytokine receptors and uncontrolled myeloid proliferation. Mutations in CALR (CALRmut) are associated with approximately 30% of ETs and PMFs. Two types of CALRmut are more frequent, CALRdel52 and CALRins5 are found in ET, while CALRdel52 is predominant in MFP. The goal of my thesis project is to understand the basis of the phenotypic differences induced by the two types of CALRmut, CALRdel52 and CALRins5, using knock-in (KI) mouse models generated in the laboratory. These mice express murine CALRdel52 and CALRins5 with the human mutated C-terminal tail. Comparative study of the hematopoiesis of KI CALRdel52 and KI CALRins5 mice showed that CALRdel52 mice develop a more severe phenotype than KI CALRins5 mice in terms of thrombocytosis and progression to MF, and in homozygous than heterozygous context. HSC amplification and competitive advantage, as well as MK amplification, are most prominent in the CALRdel52 homozygous context. The phenotype of heterozygous CALRins5 is almost indistinguishable from that of controls, whereas heterozygous CALRdel52 develop intermediate disease. Although these mice globally mimic human disease with a more severe effect of CALRdel52 compared to CALRins5, we observed more moderate phenotypes than patients in terms of thrombocytosis and progression to myelofibrosis, particularly for heterozygous mice. We demonstrated that the human/mouse differences were due to suboptimal activation of the JAK2/STAT5 pathway by murine MPL compared to human MPL regardless of mutants (in vitro luciferase assays). Furthermore, using a competitive grafting (2:8) between CALRins5 homozygous and CALRins5 heterozygous clones we found that homozygosity, more often observed in CALRins5 than CALRdel52 patients, plays a key role in the severity of thrombocytosis and allows to reach or exceed CALRdel52 induced thrombocytosis (Benlabiod et al., 2020). The second part of my work focused on investigating the mechanisms that explain the difference in phenotype between these two mutants. Using flow cytometry analysis, it was observed that CALRdel52 homozygous HSCs divide more than CALRins5 homozygous HSCs. In parallel, I could observe a different signaling between the two mutant HSCs by mass cytometry. Indeed, CALRdel52 HSCs express more strongly p-EIF2a which is an actor of the endoplasmic reticulum stress response. scRNA-seq results are currently being analyzed and should allow us to understand more fully the phenotypic differences observed between these two mutants.</abstract><oa>free_for_read</oa></addata></record> |
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| subjects | Calreticulin Calréticuline Cellule souche hématopoïétique Hematopoietic stem cell Knock-In mouse model Megakaryocyte Modèle de souris knock-In Myeloproliferative neoplasms Mégakaryocyte Néoplasmes myéloprolifératifs |
| title | Étude des mécanismes d'action expliquant les différences phénotypiques entre les mutants de la calréticuline del52 et ins5 dans les néoplasmes myéloprolifératifs |
| url | https://sfx.bib-bvb.de/sfx_tum?ctx_ver=Z39.88-2004&ctx_enc=info:ofi/enc:UTF-8&ctx_tim=2024-12-30T02%3A24%3A07IST&url_ver=Z39.88-2004&url_ctx_fmt=infofi/fmt:kev:mtx:ctx&rfr_id=info:sid/primo.exlibrisgroup.com:primo3-Article-abes_RS3&rft_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:dissertation&rft.genre=dissertation&rft.btitle=%C3%89tude%20des%20m%C3%A9canismes%20d'action%20expliquant%20les%20diff%C3%A9rences%20ph%C3%A9notypiques%20entre%20les%20mutants%20de%20la%20calr%C3%A9ticuline%20del52%20et%20ins5%20dans%20les%20n%C3%A9oplasmes%20my%C3%A9loprolif%C3%A9ratifs&rft.au=Benlabiod,%20Cam%C3%A9lia&rft.date=2022-11-30&rft_id=info:doi/&rft_dat=%3Cabes_RS3%3E2022UNIP5113%3C/abes_RS3%3E%3Curl%3E%3C/url%3E&disable_directlink=true&sfx.directlink=off&sfx.report_link=0&rft_id=info:oai/&rft_id=info:pmid/&rfr_iscdi=true |