Étude fonctionnelle de la protéine PfKelch13 impliquée dans la résistance de Plasmodium falciparum à l'artémisinine
Le paludisme est une maladie infectieuse causée par des parasites unicellulaires du genre Plasmodium transmis à l'Homme par piqûre d'anophèles. Depuis les années 2000, des parasites résistants aux traitements de première intention à base d'artémisinine se sont répandus en Asie du Sud-...
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| description | Le paludisme est une maladie infectieuse causée par des parasites unicellulaires du genre Plasmodium transmis à l'Homme par piqûre d'anophèles. Depuis les années 2000, des parasites résistants aux traitements de première intention à base d'artémisinine se sont répandus en Asie du Sud-Est, et depuis très récemment en Afrique de l'Est. Cette résistance à l'artémisinine se traduit cliniquement par un allongement de la durée d'élimination des parasites après traitement et est déterminée par des mutations non-synonymes dans le gène pfkelch13 (pfk13). PfK13 est une protéine essentielle chez P. falciparum et est localisée à la surface du parasite dans des structures impliquées dans l'endocytose de l'hémoglobine de la cellule hôte. Les mutations de résistance sont principalement localisées dans le domaine propeller de PfK13 et diminuent le catabolisme de l'hémoglobine qui contrôle l'activation de l'artémisinine en dérivés toxiques. Ces mutations entraînent une perte d'activité globale de PfK13 par diminution de la quantité cellulaire de la protéine. Les régions fonctionnelles de PfK13 sont cependant très mal caractérisées. Des études évolutives et structurales réalisés récemment dans notre laboratoire ont mis en évidence une poche extrêmement conservée à la surface du domaine propeller de PfK13 et que nous supposons être une zone fonctionnelle. Ce travail a pour objectif de tester expérimentalement, par des approches génétiques et pharmacologiques, si la poche conservée du domaine propeller de PfK13 est associée à un rôle fonctionnel. Plusieurs résidus d'acides aminés de cette poche (R529, R597, S576, S577, et E688) ont été identifiées in silico comme potentiellement critiques considérant leur localisation, leur conservation au cours de l'évolution, et leurs propriétés physico-chimiques. Des transfections ont été réalisées par la méthode selection-linked integration pour créer des parasites mutants artificiels (R529K, R529Q, R529A, R597K, R597Q, R597A, double mutant S576A-S577A, et E688K), un contrôle sauvage (WT) et un mutant connu de résistance à l'artémisinine (C580Y). Les lignées transgéniques R529A et R597A n'ont jamais été obtenues, malgré six tentatives indépendantes. Pour tester la solubilité des protéines mutantes PfK13 R529A et R597A, un protocole d'expression chez Escherichia coli a été développé. Dans nos conditions expérimentales, la solubilité des protéines mutantes purifiées était similaire à celle de la protéine sauvage, suggérant que ces mutations |
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Malaria is an infectious disease caused by single-celled parasites of the Plasmodium genus and transmitted to humans by anopheles bites. Since the 2000s, parasites resistant to artemisinin-based first-line treatments have largely spread in Southeast Asia, and have recently emerged locally in some East African settings. This resistance phenotype manifests clinically as a prolonged parasite clearance time after treatment and is primarily conferred by non-synonymous mutations in the pfkelch13 (pfk13) gene. PfK13 is an essential protein in P. falciparum biology and is localized on the parasite surface in structures involved in the endocytosis of host cell hemoglobin. Resistance mutations are almost all located in the propeller domain of PfK13 and decrease hemoglobin catabolism which controls the activation of artemisinin to toxic derivatives. These mutations result in a loss of overall PfK13 activity by decreasing the cellular amount of the protein. However, the functional regions of PfK13 are poorly characterized. Recent evolutionary and structural studies performed in our laboratory have revealed a highly conserved "shallow" pocket on the surface of the propeller domain of PfK13 that we hypothesize to be of functional importance. The aim of this work is to test experimentally, using both genetic and pharmacological approaches, whether the pocket of PfK13 propeller is associated with a functional role. Several amino acid residues of this pocket (R529, R597, S576, S577, and E688) were identified in silico as potentially critical considering their localization on the protein structure, their conservation during species evolution, and their physicochemical properties. Transfections were performed by the selection-linked integration method to create artificial mutant parasites (R529K, R529Q, R529A, R597K, R597Q, R597A, S576A-S577A double mutant, and E688K), a wild-type control (WT) and a known artemisinin resistance mutant (C580Y). Two transgenic lines, R529A and R597A, were never obtained despite six independent attempts. To test the solubility of the PfK13 R529A and R597A mutant proteins, an expression protocol in Escherichia coli was developed. Under our experimental conditions, the solubility of the purified mutant proteins was similar to that of the wild-type protein, suggesting that these mutations may alter other protein properties. The other eight transgenic lines were validated for chromosomal integration (PCR and Sanger sequencing), detection of PfK13 by western-blot, and intracellular localization of the Green Fluorescent Protein tag fused to PfK13. The in vitro resistance phenotype of the artificial mutants was determined by the RSA0-3h technique, which measures the survival rate of parasites after exposure to dihydroartemisinin. A slightly but significantly increased survival rate was measured for several lines (R529Q, R529K, R597K, and S576A-S577A), suggesting an alteration of PfK13 activity for these mutants. Further experiments are underway to determine whether these mutations alter the amount or other properties of PfK13. In addition, nine known inhibitors of the KEAP1 propeller pocket (human homolog to PfK13) were selected by molecular docking as candidate molecules to target the PfK13 pocket. Four of these molecules moderately inhibited parasite growth in vitro, although we do not currently know whether these molecules target the PfK13 pocket. In conclusion, this work shows that several positions in the pocket of the propeller domain contribute to PfK13 activity, as some mutations appear critical for parasite survival or associated with an artemisinin resistance phenotype.</description><language>fre</language><subject>Artemisinin ; Artémisinine ; Dynamique moléculaire ; Functional study ; Growth inhibitory ; Inhibition de croissance ; Lignées transgéniques ; Molecular dynamic ; Pfk13 ; Propeller ; Protein purification ; Purification de protéine ; Resistance ; RSA0-3h ; Résistance ; Transgenic lines ; Étude fonctionnelle</subject><creationdate>2022</creationdate><oa>free_for_read</oa><woscitedreferencessubscribed>false</woscitedreferencessubscribed></display><links><openurl>$$Topenurl_article</openurl><openurlfulltext>$$Topenurlfull_article</openurlfulltext><thumbnail>$$Tsyndetics_thumb_exl</thumbnail><link.rule.ids>230,311,780,885,26981</link.rule.ids><linktorsrc>$$Uhttps://www.theses.fr/2022UNIP5028/document$$EView_record_in_ABES$$FView_record_in_$$GABES$$Hfree_for_read</linktorsrc></links><search><creatorcontrib>Rondepierre, Laurine</creatorcontrib><title>Étude fonctionnelle de la protéine PfKelch13 impliquée dans la résistance de Plasmodium falciparum à l'artémisinine</title><description>Le paludisme est une maladie infectieuse causée par des parasites unicellulaires du genre Plasmodium transmis à l'Homme par piqûre d'anophèles. Depuis les années 2000, des parasites résistants aux traitements de première intention à base d'artémisinine se sont répandus en Asie du Sud-Est, et depuis très récemment en Afrique de l'Est. Cette résistance à l'artémisinine se traduit cliniquement par un allongement de la durée d'élimination des parasites après traitement et est déterminée par des mutations non-synonymes dans le gène pfkelch13 (pfk13). PfK13 est une protéine essentielle chez P. falciparum et est localisée à la surface du parasite dans des structures impliquées dans l'endocytose de l'hémoglobine de la cellule hôte. Les mutations de résistance sont principalement localisées dans le domaine propeller de PfK13 et diminuent le catabolisme de l'hémoglobine qui contrôle l'activation de l'artémisinine en dérivés toxiques. Ces mutations entraînent une perte d'activité globale de PfK13 par diminution de la quantité cellulaire de la protéine. Les régions fonctionnelles de PfK13 sont cependant très mal caractérisées. Des études évolutives et structurales réalisés récemment dans notre laboratoire ont mis en évidence une poche extrêmement conservée à la surface du domaine propeller de PfK13 et que nous supposons être une zone fonctionnelle. Ce travail a pour objectif de tester expérimentalement, par des approches génétiques et pharmacologiques, si la poche conservée du domaine propeller de PfK13 est associée à un rôle fonctionnel. Plusieurs résidus d'acides aminés de cette poche (R529, R597, S576, S577, et E688) ont été identifiées in silico comme potentiellement critiques considérant leur localisation, leur conservation au cours de l'évolution, et leurs propriétés physico-chimiques. Des transfections ont été réalisées par la méthode selection-linked integration pour créer des parasites mutants artificiels (R529K, R529Q, R529A, R597K, R597Q, R597A, double mutant S576A-S577A, et E688K), un contrôle sauvage (WT) et un mutant connu de résistance à l'artémisinine (C580Y). Les lignées transgéniques R529A et R597A n'ont jamais été obtenues, malgré six tentatives indépendantes. Pour tester la solubilité des protéines mutantes PfK13 R529A et R597A, un protocole d'expression chez Escherichia coli a été développé. Dans nos conditions expérimentales, la solubilité des protéines mutantes purifiées était similaire à celle de la protéine sauvage, suggérant que ces mutations pourraient altérer d'autres propriétés de la protéine. Les huit autres lignées transgéniques ont été validées concernant l'intégration chromosomique (PCR et séquençage), la détection de PfK13 par western-blot, et la localisation intracellulaire du tag Green Fluorescent Protein fusionné à PfK13. Le phénotype de résistance in vitro des mutants artificiels a été déterminé par la technique du RSA0-3h, permettant de mesurer le taux de survie des parasites après exposition à la dihydroartémisinine. Un taux de survie légèrement mais significativement augmenté a été mesuré pour plusieurs lignées (R529Q, R529K, R597K, et S576A-S577A), suggérant une modification de l'activité de PfK13 pour ces mutants. Des expériences complémentaires sont en cours pour déterminer si ces mutations dans la poche modifient la quantité ou d'autres propriétés de PfK13. En complément, neuf inhibiteurs connus de la poche du propeller de KEAP1 (homologue humain de PfK13) ont été sélectionnés par docking moléculaire comme molécules candidates ciblant la poche de PfK13. Quatre de ces molécules ont inhibé modérément la croissance parasitaire in vitro, bien que l'on ignore à ce stade si ces molécules ciblent effectivement la poche de PfK13. En conclusion, ces travaux montrent que plusieurs positions de la poche du domaine propeller contribuent à l'activité de PfK13, car certaines mutations semblent critiques pour la survie du parasite et d'autres sont associées à un phénotype de résistance à l'artémisinine.
Malaria is an infectious disease caused by single-celled parasites of the Plasmodium genus and transmitted to humans by anopheles bites. Since the 2000s, parasites resistant to artemisinin-based first-line treatments have largely spread in Southeast Asia, and have recently emerged locally in some East African settings. This resistance phenotype manifests clinically as a prolonged parasite clearance time after treatment and is primarily conferred by non-synonymous mutations in the pfkelch13 (pfk13) gene. PfK13 is an essential protein in P. falciparum biology and is localized on the parasite surface in structures involved in the endocytosis of host cell hemoglobin. Resistance mutations are almost all located in the propeller domain of PfK13 and decrease hemoglobin catabolism which controls the activation of artemisinin to toxic derivatives. These mutations result in a loss of overall PfK13 activity by decreasing the cellular amount of the protein. However, the functional regions of PfK13 are poorly characterized. Recent evolutionary and structural studies performed in our laboratory have revealed a highly conserved "shallow" pocket on the surface of the propeller domain of PfK13 that we hypothesize to be of functional importance. The aim of this work is to test experimentally, using both genetic and pharmacological approaches, whether the pocket of PfK13 propeller is associated with a functional role. Several amino acid residues of this pocket (R529, R597, S576, S577, and E688) were identified in silico as potentially critical considering their localization on the protein structure, their conservation during species evolution, and their physicochemical properties. Transfections were performed by the selection-linked integration method to create artificial mutant parasites (R529K, R529Q, R529A, R597K, R597Q, R597A, S576A-S577A double mutant, and E688K), a wild-type control (WT) and a known artemisinin resistance mutant (C580Y). Two transgenic lines, R529A and R597A, were never obtained despite six independent attempts. To test the solubility of the PfK13 R529A and R597A mutant proteins, an expression protocol in Escherichia coli was developed. Under our experimental conditions, the solubility of the purified mutant proteins was similar to that of the wild-type protein, suggesting that these mutations may alter other protein properties. The other eight transgenic lines were validated for chromosomal integration (PCR and Sanger sequencing), detection of PfK13 by western-blot, and intracellular localization of the Green Fluorescent Protein tag fused to PfK13. The in vitro resistance phenotype of the artificial mutants was determined by the RSA0-3h technique, which measures the survival rate of parasites after exposure to dihydroartemisinin. A slightly but significantly increased survival rate was measured for several lines (R529Q, R529K, R597K, and S576A-S577A), suggesting an alteration of PfK13 activity for these mutants. Further experiments are underway to determine whether these mutations alter the amount or other properties of PfK13. In addition, nine known inhibitors of the KEAP1 propeller pocket (human homolog to PfK13) were selected by molecular docking as candidate molecules to target the PfK13 pocket. Four of these molecules moderately inhibited parasite growth in vitro, although we do not currently know whether these molecules target the PfK13 pocket. In conclusion, this work shows that several positions in the pocket of the propeller domain contribute to PfK13 activity, as some mutations appear critical for parasite survival or associated with an artemisinin resistance phenotype.</description><subject>Artemisinin</subject><subject>Artémisinine</subject><subject>Dynamique moléculaire</subject><subject>Functional study</subject><subject>Growth inhibitory</subject><subject>Inhibition de croissance</subject><subject>Lignées transgéniques</subject><subject>Molecular dynamic</subject><subject>Pfk13</subject><subject>Propeller</subject><subject>Protein purification</subject><subject>Purification de protéine</subject><subject>Resistance</subject><subject>RSA0-3h</subject><subject>Résistance</subject><subject>Transgenic lines</subject><subject>Étude fonctionnelle</subject><fulltext>true</fulltext><rsrctype>dissertation</rsrctype><creationdate>2022</creationdate><recordtype>dissertation</recordtype><sourceid>RS3</sourceid><recordid>eNqFjDEKwkAURNNYiHoGt7MSYoJgL4oiSAqt5bv-kA9_d-P-TeERvIVtzrEXcxV7qxlm3swwe8Rn6G6oamd1IGctMqNKAYNqvQuxJ4uqqg_IulmUikzLdO9inyCw8sF87IUkgNXfYcUgxt2oM6oG1tSCTza-FM_Apz9DQjadjrNB6gUnPx1l0-3mtN7N4YpyCQ1KkiIvivNxXy3zYlX-J97EFkjM</recordid><startdate>20220524</startdate><enddate>20220524</enddate><creator>Rondepierre, Laurine</creator><scope>AOWWY</scope><scope>RS3</scope><scope>~IT</scope></search><sort><creationdate>20220524</creationdate><title>Étude fonctionnelle de la protéine PfKelch13 impliquée dans la résistance de Plasmodium falciparum à l'artémisinine</title><author>Rondepierre, Laurine</author></sort><facets><frbrtype>5</frbrtype><frbrgroupid>cdi_FETCH-abes_theses_2022UNIP50283</frbrgroupid><rsrctype>dissertations</rsrctype><prefilter>dissertations</prefilter><language>fre</language><creationdate>2022</creationdate><topic>Artemisinin</topic><topic>Artémisinine</topic><topic>Dynamique moléculaire</topic><topic>Functional study</topic><topic>Growth inhibitory</topic><topic>Inhibition de croissance</topic><topic>Lignées transgéniques</topic><topic>Molecular dynamic</topic><topic>Pfk13</topic><topic>Propeller</topic><topic>Protein purification</topic><topic>Purification de protéine</topic><topic>Resistance</topic><topic>RSA0-3h</topic><topic>Résistance</topic><topic>Transgenic lines</topic><topic>Étude fonctionnelle</topic><toplevel>online_resources</toplevel><creatorcontrib>Rondepierre, Laurine</creatorcontrib><collection>Theses.fr (Open Access)</collection><collection>Theses.fr</collection><collection>Thèses.fr</collection></facets><delivery><delcategory>Remote Search Resource</delcategory><fulltext>fulltext_linktorsrc</fulltext></delivery><addata><au>Rondepierre, Laurine</au><format>dissertation</format><genre>dissertation</genre><ristype>THES</ristype><btitle>Étude fonctionnelle de la protéine PfKelch13 impliquée dans la résistance de Plasmodium falciparum à l'artémisinine</btitle><date>2022-05-24</date><risdate>2022</risdate><abstract>Le paludisme est une maladie infectieuse causée par des parasites unicellulaires du genre Plasmodium transmis à l'Homme par piqûre d'anophèles. Depuis les années 2000, des parasites résistants aux traitements de première intention à base d'artémisinine se sont répandus en Asie du Sud-Est, et depuis très récemment en Afrique de l'Est. Cette résistance à l'artémisinine se traduit cliniquement par un allongement de la durée d'élimination des parasites après traitement et est déterminée par des mutations non-synonymes dans le gène pfkelch13 (pfk13). PfK13 est une protéine essentielle chez P. falciparum et est localisée à la surface du parasite dans des structures impliquées dans l'endocytose de l'hémoglobine de la cellule hôte. Les mutations de résistance sont principalement localisées dans le domaine propeller de PfK13 et diminuent le catabolisme de l'hémoglobine qui contrôle l'activation de l'artémisinine en dérivés toxiques. Ces mutations entraînent une perte d'activité globale de PfK13 par diminution de la quantité cellulaire de la protéine. Les régions fonctionnelles de PfK13 sont cependant très mal caractérisées. Des études évolutives et structurales réalisés récemment dans notre laboratoire ont mis en évidence une poche extrêmement conservée à la surface du domaine propeller de PfK13 et que nous supposons être une zone fonctionnelle. Ce travail a pour objectif de tester expérimentalement, par des approches génétiques et pharmacologiques, si la poche conservée du domaine propeller de PfK13 est associée à un rôle fonctionnel. Plusieurs résidus d'acides aminés de cette poche (R529, R597, S576, S577, et E688) ont été identifiées in silico comme potentiellement critiques considérant leur localisation, leur conservation au cours de l'évolution, et leurs propriétés physico-chimiques. Des transfections ont été réalisées par la méthode selection-linked integration pour créer des parasites mutants artificiels (R529K, R529Q, R529A, R597K, R597Q, R597A, double mutant S576A-S577A, et E688K), un contrôle sauvage (WT) et un mutant connu de résistance à l'artémisinine (C580Y). Les lignées transgéniques R529A et R597A n'ont jamais été obtenues, malgré six tentatives indépendantes. Pour tester la solubilité des protéines mutantes PfK13 R529A et R597A, un protocole d'expression chez Escherichia coli a été développé. Dans nos conditions expérimentales, la solubilité des protéines mutantes purifiées était similaire à celle de la protéine sauvage, suggérant que ces mutations pourraient altérer d'autres propriétés de la protéine. Les huit autres lignées transgéniques ont été validées concernant l'intégration chromosomique (PCR et séquençage), la détection de PfK13 par western-blot, et la localisation intracellulaire du tag Green Fluorescent Protein fusionné à PfK13. Le phénotype de résistance in vitro des mutants artificiels a été déterminé par la technique du RSA0-3h, permettant de mesurer le taux de survie des parasites après exposition à la dihydroartémisinine. Un taux de survie légèrement mais significativement augmenté a été mesuré pour plusieurs lignées (R529Q, R529K, R597K, et S576A-S577A), suggérant une modification de l'activité de PfK13 pour ces mutants. Des expériences complémentaires sont en cours pour déterminer si ces mutations dans la poche modifient la quantité ou d'autres propriétés de PfK13. En complément, neuf inhibiteurs connus de la poche du propeller de KEAP1 (homologue humain de PfK13) ont été sélectionnés par docking moléculaire comme molécules candidates ciblant la poche de PfK13. Quatre de ces molécules ont inhibé modérément la croissance parasitaire in vitro, bien que l'on ignore à ce stade si ces molécules ciblent effectivement la poche de PfK13. En conclusion, ces travaux montrent que plusieurs positions de la poche du domaine propeller contribuent à l'activité de PfK13, car certaines mutations semblent critiques pour la survie du parasite et d'autres sont associées à un phénotype de résistance à l'artémisinine.
Malaria is an infectious disease caused by single-celled parasites of the Plasmodium genus and transmitted to humans by anopheles bites. Since the 2000s, parasites resistant to artemisinin-based first-line treatments have largely spread in Southeast Asia, and have recently emerged locally in some East African settings. This resistance phenotype manifests clinically as a prolonged parasite clearance time after treatment and is primarily conferred by non-synonymous mutations in the pfkelch13 (pfk13) gene. PfK13 is an essential protein in P. falciparum biology and is localized on the parasite surface in structures involved in the endocytosis of host cell hemoglobin. Resistance mutations are almost all located in the propeller domain of PfK13 and decrease hemoglobin catabolism which controls the activation of artemisinin to toxic derivatives. These mutations result in a loss of overall PfK13 activity by decreasing the cellular amount of the protein. However, the functional regions of PfK13 are poorly characterized. Recent evolutionary and structural studies performed in our laboratory have revealed a highly conserved "shallow" pocket on the surface of the propeller domain of PfK13 that we hypothesize to be of functional importance. The aim of this work is to test experimentally, using both genetic and pharmacological approaches, whether the pocket of PfK13 propeller is associated with a functional role. Several amino acid residues of this pocket (R529, R597, S576, S577, and E688) were identified in silico as potentially critical considering their localization on the protein structure, their conservation during species evolution, and their physicochemical properties. Transfections were performed by the selection-linked integration method to create artificial mutant parasites (R529K, R529Q, R529A, R597K, R597Q, R597A, S576A-S577A double mutant, and E688K), a wild-type control (WT) and a known artemisinin resistance mutant (C580Y). Two transgenic lines, R529A and R597A, were never obtained despite six independent attempts. To test the solubility of the PfK13 R529A and R597A mutant proteins, an expression protocol in Escherichia coli was developed. Under our experimental conditions, the solubility of the purified mutant proteins was similar to that of the wild-type protein, suggesting that these mutations may alter other protein properties. The other eight transgenic lines were validated for chromosomal integration (PCR and Sanger sequencing), detection of PfK13 by western-blot, and intracellular localization of the Green Fluorescent Protein tag fused to PfK13. The in vitro resistance phenotype of the artificial mutants was determined by the RSA0-3h technique, which measures the survival rate of parasites after exposure to dihydroartemisinin. A slightly but significantly increased survival rate was measured for several lines (R529Q, R529K, R597K, and S576A-S577A), suggesting an alteration of PfK13 activity for these mutants. Further experiments are underway to determine whether these mutations alter the amount or other properties of PfK13. In addition, nine known inhibitors of the KEAP1 propeller pocket (human homolog to PfK13) were selected by molecular docking as candidate molecules to target the PfK13 pocket. Four of these molecules moderately inhibited parasite growth in vitro, although we do not currently know whether these molecules target the PfK13 pocket. In conclusion, this work shows that several positions in the pocket of the propeller domain contribute to PfK13 activity, as some mutations appear critical for parasite survival or associated with an artemisinin resistance phenotype.</abstract><oa>free_for_read</oa></addata></record> |
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| subjects | Artemisinin Artémisinine Dynamique moléculaire Functional study Growth inhibitory Inhibition de croissance Lignées transgéniques Molecular dynamic Pfk13 Propeller Protein purification Purification de protéine Resistance RSA0-3h Résistance Transgenic lines Étude fonctionnelle |
| title | Étude fonctionnelle de la protéine PfKelch13 impliquée dans la résistance de Plasmodium falciparum à l'artémisinine |
| url | https://sfx.bib-bvb.de/sfx_tum?ctx_ver=Z39.88-2004&ctx_enc=info:ofi/enc:UTF-8&ctx_tim=2025-01-05T16%3A11%3A19IST&url_ver=Z39.88-2004&url_ctx_fmt=infofi/fmt:kev:mtx:ctx&rfr_id=info:sid/primo.exlibrisgroup.com:primo3-Article-abes_RS3&rft_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:dissertation&rft.genre=dissertation&rft.btitle=%C3%89tude%20fonctionnelle%20de%20la%20prot%C3%A9ine%20PfKelch13%20impliqu%C3%A9e%20dans%20la%20r%C3%A9sistance%20de%20Plasmodium%20falciparum%20%C3%A0%20l'art%C3%A9misinine&rft.au=Rondepierre,%20Laurine&rft.date=2022-05-24&rft_id=info:doi/&rft_dat=%3Cabes_RS3%3E2022UNIP5028%3C/abes_RS3%3E%3Curl%3E%3C/url%3E&disable_directlink=true&sfx.directlink=off&sfx.report_link=0&rft_id=info:oai/&rft_id=info:pmid/&rfr_iscdi=true |